九种忍冬属植物叶片的过氧化物酶同工酶酶谱分析
摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对西宁地区的９种忍冬属（Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．）植物叶片的过氧化物酶（ＰＯＤ）同工酶酶谱进行研究，结果表明，９种植物的ＰＯＤ同工酶电泳共出现８条酶带。其中ＰＯＤ－１为试验植物材料共有的酶带，ＰＯＤ－２仅在兰果忍冬中出现，ＰＯＤ－３仅在红脉忍冬中出现，因而ＰＯＤ－2和ＰＯＤ－3可作为上述两种植物的分类鉴定依据。聚类分析结果将９种忍冬属植物分成３大类，分类结果与形态学分类结果一致。
关键词：忍冬属植物；叶片；过氧化物酶同工酶
中图分类号：Ｑ９４９．７８１．２文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3246-03
Study on Peroxidase Isozyme Pattern of Leaves of Nine Lonicera Species
ＭＡ Ｙｕ－ｈｕａ，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｊｉａｎｇ，ＳＯＮＧ Ｗｅｉ－ｘｉｕ，ＳＨＥＮＧ Ｎｉｎｇ－ｄｏｎｇ，ＭＡＯ Ｋａｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ leaves of ｎｉｎｅ Ｌｏｎｉｃｅｒａ Species ｉｎ Ｎａｎｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ８ ｂａｎｄｓ ｏｆ ＰＯＤ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｉｎ ｎｉｎｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ＰＯＤ－１ appeared ｉｎ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ considered ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．； ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ＰＯＤ－２ ａｎｄ ＰＯＤ－３ ｏｎｌｙ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ Ｌ． ｃａｅｒｕｌｅａ Ｌｉｎｎ．， Ｌ． ｔｒａｇｏｐｈｙｌｌａ Ｈｅｍｓｌ respectively， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ considered ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ． Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ at ｔｈｅ Ｊａｃｃａｒｄ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ０．６０， ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ could ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Lonicera L.； POD isozyme； leaves
忍冬属（Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．）是忍冬科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）中的一个重要属，全世界约有忍冬属植物２００种，我国有９８种［１］，青海省有忍冬属植物１９种６变种１变型［２］。忍冬属植物是优良的园林绿化树种，也是重要的药用植物，因而对忍冬属植物栽培种及原生种进行准确的鉴定和分类，是进一步做好忍冬推广应用的一项基础工作。目前，常规的形态手段进行分类鉴定的研究结果在界定忍冬属植物亲缘关系时结论差异很大，因而给忍冬属植物的品种鉴定、良种选育及推广带来很大困难。
同工酶在进化中具有一定的保守性，受基因控制，在一定程度上能够反映生物的系统发生［３］。因此，通过同工酶酶谱分析可以为植物分类和系统学提供依据［４，５］。目前，关于忍冬属植物的同工酶酶谱分析只有关于金银花同工酶酶谱分析的报道［６］，而通过同工酶酶谱分析对青海省分布或广泛引种栽培的忍冬属植物的分类研究鲜见报道。通过对青海广泛引种栽培的９种忍冬属植物的叶片ＰＯＤ同工酶酶谱进行比较分析，以期为忍冬属植物的开发利用及亲缘关系的鉴定提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
试验的９种忍冬属植物分别为红脉忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｎｅｒｖｏｓａ Ｍａｘｉｍ）、华西忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｗｅｂｂｉａｎａ）、兰果忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、陇塞忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔａｎｇｕｔｉｃａ Ｍａｘｉｍ）、金花忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ Ｔｕｒｃｚ）、金银木（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ Ｍａｘｉｍ）、盘叶忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔｒａｇｏｐｈｙｌｌａ Ｈｅｍｓｌ）、小叶忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗｉｌｌｄ． ｅｘ Ｒｏｅｍ． ｅｔ Ｓｃｈｕｌｔ）、唐古特忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔａｎｇｕｔｉｃａ Ｍａｘｉｍ）。2010年５月中旬于西宁市植物园采集９种忍冬属植物的嫩叶，采集的植物材料经清洗消毒后立即装入冰盒中带回实验室，置于超低温冰箱保存。
１．２ 试验方法
１．２．１ 酶液的提取 取１ ｇ嫩叶用液氮研磨至细粉后，加入２ ｍＬ 预冷的０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ于冰浴中提取２ ｈ，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，上清液即为酶的粗提液，－２０ ℃保存备用。
１．２．２ 电泳及染色
１）加样和电泳。采用６％分离胶、３％浓缩胶和不连续垂直板进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳进样量２０ μＬ，初始电压７０ Ｖ，待指示剂溴酚蓝进入分离胶后，稳压２００ Ｖ电泳。
２）染色。ＰＯＤ同工酶显色采用醋酸联苯胺法［７］。酶带的相对迁移率Ｒｆ计算公式为：
Ｒｆ＝酶带迁移的距离／溴酚蓝指示剂迁移的距离。
２ 结果与分析
２．１ 同工酶电泳结果
忍冬属９种植物的ＰＯＤ同工酶电泳结果模式图见图１。由图１可见，９种植物ＰＯＤ同工酶电泳共出现８条酶带，酶带条数最多的是红脉忍冬，有５条；酶带数量最少的是盘叶忍冬，仅有２条。其中ＰＯＤ－１是忍冬属植物共有的特征酶带，另外兰果忍冬和红脉忍冬各有一条特征酶带，分别为ＰＯＤ－２和ＰＯＤ－３。
２．２ 同工酶聚类分析
根据ＰＯＤ同工酶电泳后的酶带分布结果，以０和１统计建立数据库，在相同迁移率位置上有酶带的记为１，无酶带的记为０，得出酶谱的二态数据矩阵，根据酶谱的二态数据矩阵，采用Ｊａｃｃａｒｄ结合系数和类平均法（ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析，结果见图２。由图２可知，在Ｊａｃｃａｒｄ系数０．６０处可以将供试的９种植物分成３大类，即唐古特忍冬、红脉忍冬、华西忍冬、兰果忍冬、陇塞忍冬、小叶忍冬聚为第一大类，盘叶忍冬独自为第二大类，金花忍冬和金银木聚为第三大类。
２．３ 同工酶电泳聚类结果与形态学分类结果的比较
根据忍冬属植物不同品种的形态学可将试验的9个忍冬属品种分为轮花亚属和忍冬亚属，其中忍冬亚属包括直管组、囊管组、空枝组和忍冬组。试验选取的９个植物品种在形态学上的分类结果见图３。由图３可见，同工酶聚类分析中唐古特忍冬、红脉忍冬、华西忍冬、兰果忍冬、陇塞忍冬、小叶忍冬聚为第一大类，盘叶忍冬独自为第二类，金花忍冬和金银木聚为第三大类的聚类结果与形态学分类中的唐古特忍冬、陇塞忍冬、小叶忍冬、红脉忍冬、华西忍冬、兰果忍冬归为囊管组，金花忍冬和金银木归为空枝组和盘叶忍冬归为弯花亚组的分类结果是一致的，但是在囊管组中唐古特忍冬与红脉忍冬的聚类结果与同工酶聚类分析的分类结果存在差异。
３ 小结与讨论
同工酶是由结构基因编码的，是基因的直接产物，且能反映在同工酶酶谱上，具有明显的种属、组织和发育阶段特异性，另外，由于所处生长环境的不同也会引起同工酶酶谱差异（包括酶带数目、带型、迁移率等）。酶谱分析时，酶带数目的多少或某位置有无是分类的主要依据；酶带深浅表示酶活性的强弱和酶量的多少，为量的差别。当酶带数目相同但相对迁移率或酶活性不同时，仍然可作为种（尤其是品种）鉴定的依据［８］。
试验结果表明，ＰＯＤ同工酶电泳显示ＰＯＤ－１为９种植物共有的酶带，因而可作为忍冬属植物的鉴定依据；ＰＯＤ－２为兰果忍冬特有的酶带，ＰＯＤ－３为红脉忍冬特有的酶带，因而这两条酶带可分别作为这两种植物的分类鉴定依据。另外，同工酶电泳结果表明金花忍冬和金银木的ＰＯＤ同工酶酶谱完全一致，表明金花忍冬和金银木具有很近的亲缘关系。
上述研究结果表明ＰＯＤ同工酶酶谱在忍冬属植物不同种之间表现出丰富的遗传多样性，利用ＰＯＤ同工酶酶谱建立的忍冬属植物鉴定体系对于忍冬属植物分类鉴定有着十分重要的意义，可为忍冬属植物的鉴定提供有力的依据。虽然ＰＯＤ同工酶酶带在试验的9种植物中表现出了丰富的遗传多样性，但同工酶分类结果与形态学分类结果也不完全吻合，这可能是因为酶谱型只是一种表型，尽管它含有重要的生物学信息，但会受环境和人为因素的影响，在试验过程中会由于各种原因导致部分数据丢失，不能直接反映分子水平上的差异。因此，在今后的研究中应该开展多酶研究，结合多酶系统和形态特性以及生态、地理分布的研究，提高取材的代表性，使忍冬属植物的亲缘关系和分类更趋合理和真实，以便为忍冬属植物资源的开发利用提供科学依据。
参考文献：
［１］ 朱 颖，董玉芝，昝少平，等． １５种忍冬属植物的数量分类研究［Ｊ］．新疆农业科学，２００９，４６（４）：６９１－６９５．
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［４］ 葛 颂．酶电泳资料和系统与进化植物学研究综述［Ｊ］．武汉植物学研究，１９９４，１２（１）：７１－８４．
［５］ 熊金沫．同工酶电泳数据的分析及其在种群遗传上的应用［Ｊ］．遗传，１９８６，８（１）：１－５．
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［７］ 张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８１．
［８］ ＲＯＯＳＥ Ｍ Ｌ． Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔ Ｓｔｅｐｈａｎｏｍｅｒｉａ ｅｘｉｇｕａ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８４，２２（７－８）：６３１－６４３．