酸模属5种植物的过氧化物酶（POD）同工酶的比较

摘要：为了探明酸模属（Rumex）植物种间亲缘关系，采用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳技术，对酸模属5种植物的过氧化物酶（POD）同工酶进行了研究。结果显示，酸模属5种植物过氧化物酶（POD）同工酶共11条酶带，不同种间酶谱存在较大差异；聚类分析表明，齿果酸模（Rumexdentatus）、尼泊尔酸模（R.nepalensis）、钝叶酸模（R.obtusifolius）、皱叶酸模（R.crispus）这4种植物的亲缘关系较近，戟叶酸模（R.hastatus）与这4种酸模的亲缘关系较远，且戟叶酸模是5种酸模中的较原始种。由结果可知，POD酶谱在一定程度上能反映种间的遗传差异，有助于酸模属物种的鉴定及亲缘关系的探讨。

关键词：酸模属；过氧化物酶；聚类分析；亲缘关系

中图分类号：Q554+.6文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0063-03

酸模属（Rumex）是蓼科（Primulaceae）第2大属，全世界约有150种，主产北温带，我国有26种2变种[1-2]，在全国各省区均有生产，其中贵州省有7种[3-4]。酸模属可入药的植物有16种，入药部位为根，俗称“土大黄”或“野甜菜”，主要含蒽醌类、黄酮类、萘衍生物、二苯乙烯类及鞣质类等，具有清热解毒、活血止血、通便杀虫之功效，主治多种皮肤病、出血症及各种炎症[5]。现代药学研究表明，酸模属植物有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、防腐、抗肿瘤及免疫调节等作用[6]。目前国内外学者对酸模属的研究主要集中在化学成分与药理活性[5-7]、形态解剖学[8-10]及染色体核型[11]等方面，未见关于其同工酶方面的研究报道。同工酶是指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成有所不同的一组酶，广泛应用于植物系统演化研究中[12]。过氧化物酶（POD）同工酶普遍存在于各种植物组织中，易于提取和分离，并且稳定性较好，它在种质资源的分类、系统发育、亲缘关系[13]等方面的应用较广。笔者采用聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳技术，对贵州省六盘水市酸模属5种植物的过氧化物酶同工酶进行了研究，探讨其遗传结构、亲缘关系及分类，旨在为酸膜属植物的合理利用提供一定的参考资料。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料于2011年6月采自贵州省六盘水市水城县境内，基本情况详见表1，由林长松教授（博士）鉴定。凭证标本存放于六盘水师范学院生命科学系的植物标本室。

1.2试验方法

1.2.1酶液制备、电泳按实验室的常规方法进行[14-15]。

1.2.2染色取下凝胶，用蒸馏水洗2次，参照胡能书等的醋酸联苯胺法[16]进行染色。出现清晰酶带后，弃染色液，用清水洗净后拍照、测量并记录，在7%乙酸中保存。

1.2.3分析方法统计酶带数，计算其相对迁移率Rf值、酶谱相似度指数，相关公式为：

Rf值=酶带迁移距离（cm）/溴酚蓝迁移距离（cm）；

酶谱相似度指数=2个物种的相同酶带数/（2个物种的相同酶带数+2个物种的不同酶带数）。

依据数量分类中二态特征的0/1编码原则[17]，首先将各样本看成一类，对每个个体的每条酶带赋值，有酶带的记为1，无酶带的记为0，应用DPSv3.01软件，采用Jaccard系数，用类平均法（UPGMA）对酸模属5种植物进行聚类分析。

同工酶酶谱分析和命名参照熊全沫的方法[18-19]。以同工酶缩写名称的大写字母代表酶蛋白，以1、2、3……表示向阳极迁移位点，愈靠近阳极的位点以愈小的数字表示，如POD-1、POD-2等。

2结果与分析

2.1过氧化物同工酶酶谱

由图1可以看出，5种酸模属植物共检测出过氧化物酶（POD）酶谱带11条，其中齿果酸模有7条带（POD-2、POD-3、POD-4、POD-5、POD-6、POD-8、POD-10），其中POD-8、POD-10表达较强，POD-2、POD-3、POD-5、POD-6表达较弱；钝叶酸模有5条带（POD-1、POD-3、POD-4、POD-8、POD-10），其中POD-8、POD-10表达较强，POD-1、POD-3表达较弱；皱叶酸模有6条带（POD-4、POD-5、POD-6、POD-8、POD-9、POD-11），其中POD-4、POD-5、POD-6、POD-8表达较弱；尼泊尔酸模有4条带（POD-4、POD-7、POD-8、POD-10），其中POD-7、POD-8、POD-10表达较强，POD-4表达较弱；戟叶酸模只有1条带（POD-7），表达较弱。可见酸模属不同种植物酶谱带的位置、数量及强弱存在着一定的差异。

根据酶谱位置可分为2个区：Ⅰ区（Rf=0.13～0.25）和Ⅱ区（Rf=0.48～0.66），其中Ⅰ区酶带数为5条，Ⅱ区酶带数为6条，可见2个区的酶带数量、强弱不等。戟叶酸模只有1条弱带，分布在Ⅰ区，其余酸模在Ⅰ区、Ⅱ区均有酶带，且Ⅰ区酶带表达强度高于Ⅱ区。齿果酸模、钝叶酸模、皱叶酸模、尼泊尔酸模具有2条共同谱带（POD-4、POD-8），Rf值分别为0.55、0.23，占总谱带的18.18%，说明这4种酸模具有相似的遗传基础，保持着一定的遗传一致性；在2～3个种间共有酶带数为1～4条，如齿果酸模与钝叶酸模有4条共同酶带（POD-3、POD-4、POD-8、POD-10），Rf值分别为0.59、0.55、0.23、0.16，占总酶带的36.36%；齿果酸模与皱叶酸模也有4条共同酶带（POD-4、POD-5、POD-6、POD-8），Rf值分别为0.55、0.51、0.48、0.23，占总谱带的36.36%；尼泊尔酸模、齿果酸模、钝叶酸模有3条共同酶带（POD-4、POD-8、POD-10），Rf值分别为0.55、0.23、0.16，占总酶带的27.3%；皱叶酸模、钝叶酸模、尼泊尔酸模有2条共同酶带（POD-4、POD-8），Rf值分别为0.55、0.23，占总酶带的18.18%；戟叶酸模和尼泊尔酸模有1条共同酶带（POD-7），Rf值为0.25，占总酶带的9.09%；此外，齿果酸模、钝叶酸模、皱叶酸模各有1条特有酶带。总体看来，齿果酸模、钝叶酸模的酶带大部分表达较强，尼泊尔酸模的酶带表达也较强，戟叶酸模的酶带表达较弱。5种酸模均有自己的酶谱特征，POD同工酶可以将5种酸模区分开，表明酶谱特征在一定程度上能反映物种间形态上的关系。

2.2相似度指数及聚类分析

Vaughan等提出以酶谱相似度指数预测种间亲缘关系，相似度指数越大，说明物种间的酶谱差异越小，亲缘关系越密切[20]。5种酸模属植物POD酶谱的相似度指数见表2。

由表2可以看出，齿果酸模与钝叶酸模、钝叶酸模与尼泊尔酸模似度指数最大（0.500），其次是齿果酸模与皱叶酸模（0.444），戟叶酸模与齿果酸模、皱叶酸模、钝叶酸模的相似度指数最小（0），表明齿果酸模与钝叶酸模、皱叶酸模亲缘关系较近，戟叶酸模与齿果酸模、皱叶酸模、钝叶酸模的亲缘关系较远。根据相似度指数的大小，这5种植物两两之间的亲缘关系由近到远排列依次为齿果酸模-钝叶酸模/钝叶酸模-尼泊尔酸模、齿果酸模-皱叶酸模、齿果酸模-尼泊尔酸模、皱叶酸模-尼泊尔酸模、尼泊尔酸模-戟叶酸模/钝叶酸模-皱叶酸模、齿果酸模-戟叶酸模/钝叶酸模-戟叶酸模/皱叶酸模-戟叶酸模。

采用Jaccard系数，用类平均法（UPGMA）对酸模属5种植物进行（0-1）聚类分析，结果见图2。

从图2可知，酸模属5种植物被分为2个类群，类群Ⅰ包括齿果酸模、尼泊尔酸模、钝叶酸模、皱叶酸模，类群Ⅱ为戟叶酸模。说明齿果酸模、尼泊尔酸模、钝叶酸模、皱叶酸模4种植物间的亲缘关系较近，戟叶酸模与这4种酸模间的亲缘关系较远。

3讨论与结论

酸模属不同种间POD同工酶酶谱存在较大差异，酶带数目、位置及强弱不等，且有特有酶带，表现出明显的趋异性和遗传差异性，表明酶谱特征可以作为酸模属物种鉴定的依据，5种酸模属植物之间分化较明显，是分化较好的“物种”[21]。

根据Gracia等的观点，同工酶酶带数越多的种分化程度较高，是较进化种，同工酶酶带数越少的种分化程度较低，是较原始种[22]。酸模属5种植物中，齿果酸模酶带数最多（7条），戟叶酸模酶带数最少（1条），说明齿果酸模为较进化物种，戟叶酸模为较原始物种。郑水庆等的ITS结果也说明戟叶酸模是较原始物种[23]，POD同工酶结果与ITS结果相吻合，说明POD同工酶可以用于酸模属系统演化的研究。

相关数据和聚类分析显示，齿果酸模、钝叶酸模、皱叶酸模、尼泊尔酸模聚为1支，而戟叶酸模单独聚为1支，说明齿果酸模、钝叶酸模、皱叶酸模、尼泊尔酸模保持着一定的遗传一致性，其亲缘關系较近，戟叶酸模与这4种酸模亲缘关系较远，与郑水庆等的ITS序列聚类结果相一致[23]。从外部形态上看，戟叶酸模为灌木，叶为戟形，其他4种酸模均为草本，叶为长椭圆形，戟叶酸模与其他4种酸模外部形态差异较大；形态分类上戟叶酸模属于酸模亚属，其他4种酸模属于巴天酸模亚属，说明同工酶聚类分析结果与形态特征相吻合，支持李安仁对酸膜亚属及巴天酸膜亚属的划分[2]。

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