多氯联苯降解酶的分离纯化及酶学性质研究
摘要：采用硫酸铵盐析浓缩、透析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０凝胶过滤层析，对表皮葡萄球菌产生的多氯联苯（ＰＣＢｓ）降解酶进行分离纯化。粗酶经３０％～８０％饱和度硫酸铵沉淀法纯化后比酶活可提高到４４２．２９ Ｕ／ｍｇ；经透析后的比酶活可提高到４８０．７５ Ｕ／ｍｇ；最后经凝胶层析法纯化后的比酶活可提高到６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ，纯化倍数为３５．９，回收率为３０．５６％。酶催化反应的最适ｐＨ值为７．０；在ｐＨ值６．０～９．０，温度为３０～４５℃时具有较好的稳定性；Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋对酶有一定的抑制作用。
关键词：ＰＣＢｓ降解酶；纯化；酶学性质
中图分类号：Ｘ１７２；Ｑ８１４．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2207-03
Purification and Characterization of the PCBs Degrading Enzyme
ＺＨＥＮＧ Ｑｉｎｇ－ｆｅｎｇ，ＳＨＡＯ Ｓｈａｎ－ｓｈａｎ，ＬＩ Ｈａｏ，ＺＨＡＯ Ｘｉａｏ－ｘｉａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｏｎｇ Ｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１６２０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ４４２．２９ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ３０％～８０％ of （ＮＨ４）２ＳＯ４ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ４８０．７５ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｏ ６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， as ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｗａｓ ３５．９； ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ rate ｗａｓ ３０．５６％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｏｆ ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ７．０， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ ａｔ ｐＨ ６．０~９．０ ａｎｄ ３０～４５ ℃． Ｃｕ２＋ ａｎｄ Ｆｅ２＋ ｈａｄ ｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｉｓ ｅｎｚｙｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＰＣＢ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ； pｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； eｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
多氯联苯（ＰＣＢｓ）是与苯环上碳原子相连接的氢被氯不同程度地取代而形成的一类联苯化合物，广泛用作电力设备（如变压器、电容器）的绝缘液、油漆、塑料及无碳复写纸的添加剂等。在生产消费过程中，ＰＣＢｓ被排放到环境中，引起了大范围的长期污染，污染通过食物链对生物和人类产生影响，是一种致癌剂、致畸剂和致突变剂［１，２］。目前，ＰＣＢｓ污染的修复方法有高温热分解处理、微波、生物降解等。微生物法因低成本、无二次污染成为研究热点［３－６］。在国内，微生物法研究侧重于ＰＣＢｓ降解菌的筛选和降解特性方面；而在国外，除上述两点外还有学者采用植物和微生物结合共同修复ＰＣＢｓ污染［７，８］。在ＰＣＢｓ降解菌株中报道较多的有假单胞菌属、红球菌属、伯克霍尔德菌属和肠杆菌属［９－１４］。本研究对表皮葡萄球菌产生的ＰＣＢｓ降解酶进行分离与纯化，并对其酶学性质进行了初步探究；以期为ＰＣＢｓ降解酶的研究提供理论参考。
１材料与方法
１．１材料及培养基
试验用菌株表皮葡萄球菌从含有大量的油漆颗粒和清洗剂的污水中筛选获得。
无机盐培养基：磷酸二氢钾０．５ ｇ／Ｌ，磷酸氢二钾０．５ ｇ／Ｌ，硫酸镁０．２ ｇ／Ｌ，氯化钙０．１ ｇ／Ｌ，氯化钠０．２ ｇ／Ｌ，硫酸铵１．０ ｇ／Ｌ，ｐＨ值７．０。富集培养基：在无机盐培养基中加入蛋白胨２．０ ｇ／Ｌ和联苯１．０ ｇ／Ｌ。
１．２粗酶液的制备
将菌体投入含联苯１．０ ｇ／Ｌ的１５０ ｍＬ富集培养基中，３０ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ培养７２ ｈ。用中速滤纸过滤发酵液除去未溶联苯，所得菌液在４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心１５ ｍｉｎ收集菌体。用ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液清洗菌体２次，悬浮。将菌体悬浮液置于冰浴中，超声破碎细胞３０ ｍｉｎ，间隙时间３０ ｓ，工作时间３０ ｓ；所得即为粗酶液，分别测定其蛋白质含量和酶活性。
１．３蛋白质含量的测定
采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白质绘制标准曲线。
１．４酶活力的测定
取ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ３ ｍＬ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ联苯 １ ｍＬ，加入粗酶液１ ｍＬ，３５ ℃反应１ ｈ后，加入２．０ ｍＬ １０％的ＴＣＡ终止反应。４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心１５ ｍｉｎ，取上清液于２９０ ｎｍ处测其吸光度。对照组为反应前加入ＴＣＡ。酶活力单位定义为：在上述条件下，１ ｍＬ酶液催化底物引起吸光度降低０．０１为１个酶活力单位（U）。比酶活＝酶活力单位／蛋白质含量，单位为Ｕ／ｍｇ。
１．５硫酸铵盐析
向５ ｍＬ粗酶液中依次加入饱和度为０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％的硫酸铵，进行盐析沉淀，搅拌使其完全溶解，４ ℃静置过夜。４ ℃、
１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，收集上清液，测出蛋白质含量和酶活力，作盐析曲线图。
根据盐析曲线图，得到一级盐析饱和度和二级盐析饱和度。在粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为一级，静置过夜，４ ℃、８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。在上清液中继续添加硫酸铵至二级饱和度，静置过夜，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，沉淀用ｐＨ值７．４的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶解，装入透析袋，４ ℃静置过夜，测定蛋白质含量和酶活力。
１．６真空冷冻干燥
在真空冷冻干燥箱中干燥，时间不少于２４ ｈ。
１．７Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０ 凝胶层析
采用０．２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值６．８的磷酸缓冲液洗脱，洗脱速度０．５ ｍＬ／ｍｉｎ，每管收集３ ｍＬ；用核酸蛋白检测仪检测２８０ ｎｍ处光吸收。收集合并保存。
１．８ＰＣＢｓ降解酶酶学性质研究
１．８．１最适ｐＨ值和酸碱稳定性在不同ｐＨ值的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中测定酶活力，以最高的酶活力计为１００％，其他酶活力以相对酶活力（相对酶活力指所测得的酶活力值与最高酶活力值的百分比，下同）表示；确定酶的最适ｐＨ值及其酸碱稳定性。
１．８．２最适温度和温度稳定性在不同温度下测定酶活力，以最高酶活力计为１００％，其他酶活力以相对酶活力表示；确定酶的最适温度及温度稳定性。
１．８．３金属离子对酶活力的影响在加入不同种金属离子后，分别测定酶活力，以最高的酶活力计为１００％，其他酶活力以相对酶活力表示；确定金属离子对酶活的影响。
２结果与分析
２．１硫酸铵盐析
不同饱和度的硫酸铵对粗酶液的盐析情况见图１。由图１可知，饱和度在３０％～８０％内，酶活力下降较快，酶蛋白沉淀主要发生在此区间；饱和度＞８０％时，酶活力下降变得缓慢。因此，确定３０％和８０％分别为一级和二级盐析饱和度。粗酶经硫酸铵分级盐析，可去除其中杂蛋白质，同时也可浓缩酶液。
２．２凝胶层析
硫酸铵盐析试验后的样品用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０进一步分离纯化，如图２所示，只出现一个比较明显的蛋白峰，说明经盐析和透析后得到的成分较纯。
２．３纯化结果
各步纯化结果见表１。可知ＰＣＢｓ降解酶经过盐析、透析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０层析，得到较纯的酶，其比酶活由粗酶的１９２．３０ Ｕ／ｍｇ提高到纯酶的
６ ９０３．５７ Ｕ／ｍｇ，纯化３５．９倍，回收率为３０．５６％。
２．４ＰＣＢｓ降解酶酶学性质
２．４．１酶反应的最适ｐＨ值由图３可知，ＰＣＢｓ降解酶在ｐＨ值为７时，其相对酶活力达到最大值。此菌株所产酶属于中性酶，这与相关报道的酶反应的最适ｐＨ值较类似［１５］。另外，酶的最适ｐＨ值并不是固定常数，受酶的纯度、底物、缓冲液的种类等影响。
２．４．２酶反应的pH稳定性由图４可知，该酶在酸性环境中不稳定，但在碱性环境中有着较高的稳定性。ｐＨ值小于６时，相对酶活力明显下降；ｐＨ值为６时，相对酶活力高于８０％；ｐＨ值为７时，相对酶活力达到最大，为１００％；ｐＨ值大于７时，其对酶活力的影响并不大。
２．４．３酶的热稳定性由图５可知，ＰＣＢｓ降解酶在３０ ℃条件下酶活力较稳定，保温３ ｈ后相对酶活力仍高于９０％；４５ ℃条件下保温１ ｈ后相对酶活力降至５５％，而保温３ ｈ后相对酶活力降为２０％；在高于６０ ℃条件下ＰＣＢｓ降解酶迅速失活，保温１ ｈ时相对酶活力降至３０％。
２．４．４金属离子对酶反应的影响由图６可知，Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋对酶活力的影响较大，起到了一定的抑制作用；Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋对酶活影响不大；Ｎａ＋、Ａｌ３＋对酶活可能有一定的促进作用。
３小结
表皮葡萄球菌发酵产生的ＰＣＢｓ降解酶经分离纯化后，纯化倍数达３５．９，回收率为３０．５６％。通过酶学性质的研究，ＰＣＢｓ降解酶在ｐＨ值为６．０～９．０，温度为３０～４５℃时有较高的稳定性，其最适ｐＨ值为７．０，Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋对酶活的影响较大，有一定的抑制作用。
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