环氧化酶-1、环氧化酶-2、Fas配体在门脉高压大鼠胃组织中的表达及意义
[摘要] 目的 利用門脉高压大鼠模型观察环氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、Fas配体（Fas ligand，Fas-L）在其胃组织的表达情况并探讨其在门脉高压性胃病中的意义。 方法 雄性SD大鼠20只随机分为实验组和对照组，实验组采用门静脉半结扎法制作门静脉高压大鼠模型并于模型制作成功两周后测量门静脉压力；对照组为假手术组，单纯游离门静脉后缝合切口并于两周后测门静脉压力；测门静脉压后分别取实验组与对照组大鼠胃组织，运用免疫组织化学方法观察COX-1、COX-2、Fas-L的表达情况。 结果 实验组大鼠门静脉压力明显大于对照组大鼠门静脉压力（P ＜ 0.05）；实验组大鼠胃组织中COX-1表达明显低于对照组（P ＜ 0.05）；COX-2的表达二者没有明显差别；Fas-L的表达明显增高（P ＜ 0.05）。 结论 COX-1一定程度上参与了门脉高压性胃疾病的形成，而COX-2可能并没有参与这一过程的实现。
[关键词] 环氧化酶-1；环氧化酶-2；Fas配体；门脉高压性胃病
[中图分类号] R573 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）07（c）-0016-03
Expression and significant of cyclooxygenase-1, cyclooxygenase-2, Fas ligand in the gastric tissue of portal hypertensive rats
GUO ZhikunGUO JianshengMIAO Jinyang
Department of General Surgery, the First Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan030001, China
[Abstract] Objective To observe the expression of cyclooxgenase-1(COX-1), cyclooxgenase-2(COX-2) and Fas ligand (Fas-L) in the gastric tissue of portal hypertensive rats and investigate the significance in portal hypertensive gastropathy on the model of portal hypertensive rats. Methods Male SD rats were randomly divided into a experimental group and a contral group. The SD rats in experimental group were performed by partial portal vein ligation plus the ligation of the left adrenal vein and the portal vein pressure was measured in two weeks. The contral group was sham-operated, the same operation was performed with the exception that no ligature was placed after isolating the portal vein. The portal vein pressure was measured in two weeks. The expression of COX-1, COX-2 and Fas-L in the gastric tissue were observed after the portal vein measured by immunohistochemistry. Results The portal vein pressure of rats in the experimental group were significantly higher than the rats in the control group (P ＜ 0.05). The expression of COX-1 in the gatric tissue of portal hypertensive rats in experimental group was down regulated (P ＜ 0.05), however the expression of COX-2 in the gastric tissue these two groups were not significantly different between the experimental group, and the control group and the expression of Fas-L was upregulated in the experimental group (P ＜ 0.05). Conclusion The data indicate that the COX-1 certain extent in the portal hypertensive gastric disease formation, however COX-2 is probably not involved in this process.
[Key words] Cyclooxgenase-1; Cyclooxgenase-2; Fas ligand; Portal hypertensive gastropathy
门脉高压（PHT）是肝硬化导致的最常见也是最复杂的症状之一，同时也是肝硬化导致死亡的最主要原因。许多临床和实验室数据表明酒精、非甾体类抗炎药物、缺血再灌注、胃黏膜损伤与修复都增加了胃黏膜损伤的敏感性[1-2]。现在人们已经逐渐接受了PHT导致局部血液量增加、外周血液循环抵抗降低而导致心输出量增加，因而被称之为高动力循环的观点[3-5]。胃黏膜的机能障碍被认为与PHT有关，而这些机能障碍被称为门脉高压性胃病。然而具体的失代偿机理现在仍不清楚。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 兔抗鼠COX-１单克隆抗体；兔抗鼠COX-２单克隆抗体；兔抗鼠Fas-L单克隆抗体；山羊抗小鼠LgG；5%BSA封闭液；SABC。以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.1.2 动物及分组 雄性SD大鼠20只，体重220～250 g（山西医科大学实验动物中心提供）。随机分为两组。实验组：半结扎门静脉及左肾静脉组；对照组：单纯暴露游离门静脉组。
1.2 方法
1.2.1 建立门静脉高压大鼠模型 大鼠于术前12 h禁食，术前8 h禁饮。3%戊巴比妥钠针腹腔注射麻醉（0.1 mL/100 g BW）。实验组大鼠开腹后游离暴露门静脉主干后用７号钝性针头平行放置于门静脉干，用3-0丝线结扎后将钝性针头抽出，待门静脉结扎处部分充盈后轻轻结扎。然后暴露左肾上腺静脉然后结扎。
1.2.2 大鼠门静脉压力测量 于术后两周将所有大鼠麻醉后开腹，实验组大鼠用20号套管针穿刺肠系膜上静脉近端，退出针芯并将套管送入门静脉结扎远端，该处测得压力作为门静脉压；对照组则将套管针直接插入门静脉处测压，另一端接压力传感器（型号TSD104A），传感器将收集的压力信号转化为数字信号后输入计算机，采用MP2100型多道生理记录仪测定门静脉压力。
1.2.3 大鼠胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达 门静脉半结扎两周后处死大鼠，收集胃组织，甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片。用免疫组织化学的方法检测大鼠胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达情况。应用MIAS-2000型医学图像彩色分析系统测定胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的平均面积密度值，每张切片随机选取５个视野，取其均值转化为阳性单位。
1.3 统计学方法
所有数据均采用SPSS 13.0统计软件处理。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 门静脉压力的变化
门静脉半结扎两周后，实验组大鼠门静脉的压力为（28.25±2.89）cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），对照组大鼠门静脉压力为（13.07±2.74）cm H2O，实验组压力明显高于对照组（P ＜ 0.05）。
2.2 胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达
胃组织中COX-1阳性表达于黏膜层，可见黄色产物，阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒，实验组COX-1表达强度较对照组明显减弱。胃组织中COX-2阳性表达于黏膜层，可见黄色产物，阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒，实验组COX-2表达强度较对照组无明显差别。胃组织中Fas-L阳性表达于黏膜层，可见棕黄色产物，阳性细胞为胞浆内可见棕黄色颗粒，实驗组Fas-L表达强度较对照组明显增强。见表1。
表1胃组织中COX-1、COX-2、Fas-L的表达（x±s）
注：对照组比较，*P ＜ 0.05
3 讨论
目前在认识PHT的过程中，前列腺素类（ＰＧs）在其中所起的作用仍比较有争议。在人体试验中胃黏膜中的前列腺素水平显示出增加，降低，或并无差异，但动物试验中胃黏膜中前列腺素水平显示降低[6-8]。但无论是在动物模型还是人体试验中运用前列腺素抑制剂后，胃黏膜均呈现不同程度的损害。环氧合酶（ＣＯＸ）是花生四烯酸合成前列腺素和血栓素中的关键酶。目前至少存在3种环氧化酶。ＣＯＸ-１主要存在于胃肠道以及大多数组织中，ＣＯＸ-２更容易在炎症部位表达，而ＣＯＸ-３则是新一代抗炎镇痛药物的重要代表[9-10]。ＣＯＸ-１和ＣＯＸ-２在不同组织细胞中的作用有所不同，而对同一细胞在不同条件下其作用也不相同。ＣＯＸ-１与ＣＯＸ-２是否参与了门脉高压性胃病形成过程以及其形成的机理目前并不清楚。
通过本试验笔者证明了两步结扎法可以明显的使大鼠门静脉压力增高，且可诱导内脏血管阻塞和肠系膜静脉扩张。此外笔者发现门静脉高压大鼠模型中胃黏膜中ＣＯＸ-１表达降低而ＣＯＸ-２的表达并无明显异常，同时细胞凋亡因子Fas-L的表达水平明显增加。
TＮＦ受体家族中凋亡因子Fas配体Fas-L除主要在活化的Ｔ淋巴细胞和自然杀伤细胞中表达外还出现在免疫豁免的部位。Fas作为细胞膜抗原主要介导细胞凋亡，具有抵抗Bcl-２蛋白抑制细胞凋亡的作用。Suda等人克隆了Fas抗原配体（Fas-L），已产生出Fas-L单克隆抗体，发现Fas-L同样有促进细胞凋亡的作用。
由于ＣＯＸ-１和ＣＯＸ-２的不同表达方式导致了其不同的病理生理作用。目前认为ＣＯＸ-１源性酶催化生成的ＰＧｓ参与了稳态反应，而ＣＯＸ-２源性酶催化生成的ＣＯＸ-２则参与了炎性以及癌变的病理过程。胃部的PG合成主要为ＣＯＸ-１源性。但是最近的研究发现ＣＯＸ-２源性PG在某种条件下可以参与胃黏膜的保护作用[11]。通过本研究发现PHT明显的抑制了ＣＯＸ-１在胃黏膜中的表达，但是并没有抑制ＣＯＸ-２的表达。试验数据表明PHT抑制了ＣＯＸ-１源性ＰＧE2在胃黏膜的产生。而ＣＯＸ-１源性ＰＧE2对胃黏膜具有保护作用，但其具体机制目前还不清楚。ＣＯＸ-２源性ＰＧs被认为参与局部炎症反应，目前已被广泛接受，本实验数据表明门脉高压并没有造成明显的胃黏膜炎性反应。在胃组织中由于ＣＯＸ-１分布的特异性，也可能大量的ＣＯＸ-１源性ＰＧE2的表达掩盖了ＣＯＸ-２源性ＰＧs的作用。
总的来说，Fas-L的高表达说明门脉高压性胃肠病的形成过程中胃黏膜细胞的增殖作用减弱，同时存在促凋亡作用增强。由ＣＯＸ-１源性ＰＧE2表达的降低导致胃黏膜防护机制减弱，也可能通过促进胃黏膜细胞凋亡及ＰＧE2分泌紊乱引起的局部血管舒缩活性异常及体液调节失调后共同作用引起的内脏血管高动力实现。实验结果表明，门脉高压导致ＣＯＸ-１局部胃黏膜低表达可能通过凋亡途径参与了门脉高压胃病的形成过程，其具体机制目前还不清楚。而ＣＯＸ-２表达无差异表明炎症反应可能并没有参与门脉高压的形成过程，或者在其形成过程中不起主要作用。
[参考文献]
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（收稿日期：2012-03-01 本文編辑：郝明明）