不同施氮水平对烤烟叶片关键酶活性的影响
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摘要 采取大田试验，以烤烟品种云烟87为试验材料，研究不同施氮水平对烤烟叶片硝酸还原酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和丙二醛含量等生理指标的影响。结果表明，15～75 kg/hm2施氮水平范围内在烤烟整个生育期，硝酸还原酶活性先升高后下降，并在60 d左右达到最高水平;丙二醛含量随着生育期的延长不断升高;超氧化物歧化酶活性随生育期先升高后降低;过氧化物酶活性随生育期不断下降。在同一生育时期内，硝酸还原酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性随施氮水平的升高而升高，丙二醛含量随施氮水平的提高而有所下降。因此，适当增加氮肥使用量有利于烤烟的生长发育和氮同化，提高烤烟的抗衰老、抗逆性和抗氧化能力。
关键词 烤烟;施氮水平;叶片;酶活性
中图分类号 S572 文献标识码 A
文章编号 1007-5739（2019）20-0016-03 开放科学（资源服务）标识码（OSID）
Abstract Taking Yunyan 87 as the test material，the field test was conducted to study the effects of different nitrogen application levels on the physiological indexes such as nitrate reductase activity，superoxide dismutase activity，peroxidase activity and malondialdehyde content in flue-cured tobacco leaves. The results showed that during the whole growth period of flue-cured tobacco，nitrate reductase activity first increased and then decreased，and reached the highest level at about 60 days.The content of malondialdehyde increased with the prolongation of growth period.The activity of superoxide dismutase first increased and then decreased with the growth period.Peroxidase activity decreased with the growth period.During the same growth period，nitrate reductase activity，superoxide dismutase activity and peroxidase activity increased with the increase of nitrogen application level，while malondialdehyde content decreased with the increase of nitrogen application level.The results showed that increasing the use of nitrogen fertilizer was beneficial to the growth and nitrogen assimilation of flue-cured tobacco，and improve the anti-aging，stress resistance and antioxidant capacity of flue-cured tobacco.
Key words flue-cured tobacco;nitrogen application level;blade;enzymatic activity
氮素是自然界中所有生命個体的最基本元素，也是影响烤烟质量和产量的最重要因素之一。烟叶的产量和品质决定了其经济效益。要想获得优质高产的烤烟，必须严格控制氮素用量。因此，人们常通过控制氮肥施用量的方法来调控烤烟生长的氮素水平，从而调控烤烟的生长。氮肥使用过多，烤烟生长期延长，采摘期不会自然退黄，形成“黑爆烟”，制作的成烟品质也很差;氮肥使用量不够，不利于烟草早产快发，烟株生长延缓，各种化学成分含量不均衡，产量也会下降，烘烤后的烟叶叶片又薄又轻，质量低劣，因而适宜的施氮水平是获得优质高产烟叶的前提。本文通过研究烤烟叶片几种关键酶活性，明确烤烟生长的内在生理变化。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试烤烟品种为云烟87。
1.2 试验设计
采用大田试验，共设置6个氮素水平处理，分别为CK，空白，不施氮肥;N1，低氮，15 kg/hm2;N2，中低氮，30 kg/hm2;N3，中氮，45 kg/hm2;N4，中高氮，60 kg/hm2;N5，高氮，75 kg/hm2。3次重复，随机区组排列，小区面积66.7 m2。
1.3 试验过程
烤烟于2017年5月9日移栽，行距1.20 m，株距0.55 m，其中CK、N1、N2、N4、N5的磷、钾水平以N3为准（N∶P2O5∶K2O=1∶2∶3），其他栽培管理措施保持一致。
1.4 测定指标与方法
在烤烟移栽后共取样5次，分别在烤烟移栽后30、45、60、75、90 d时选取生长状态良好、无病虫害的烟株，取功能叶片作为检测对象，测定硝酸还原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性。不同指标具体测定方法如下：硝酸还原酶活性采用活体法[1]测定、丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法[2]测定、超氧化物歧化酶活性采用NBT光化还原法[3]测定、过氧化物酶采用愈创木酚法[4]测定。
1.5 统计分析方法
采用Microsoft Word 2013、Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0数据处理软件，对测定的数据进行整理、分析，采用LSD法检验差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同施氮水平对烤烟叶片硝酸还原酶活性的影响
硝酸还原酶（NR）是烟草氮代谢的一个重要的调节酶和限速酶，烟草体内硝酸还原酶活性的强弱能直接影响其对氮素的利用效率，从而影响烟草体内有机物质的合成，因而可以用硝酸还原酶的活性来表示烟草氮代谢的强弱，将其作为烟草氮素营养诊断指标[5]。
由图1可以看出，在整个生育期内，整个大田的烤烟叶片硝酸还原酶活性总体上呈先上升后下降的趋势，前期上升趋势较缓慢，然后呈迅速下降趋势。在烤烟各个不同的生育时期，其叶片中硝酸还原酶活性总体表现均为N5>N4>N3>N2>N1>CK，在每个生育期内施氮量最高N5（75 kg/hm2）的情況下硝酸还原酶活性均为最高，在不施氮肥的的情况下（CK）除75 d时硝酸还原酶活性有所偏差外，其余各时期硝酸还原酶活性均为最低。由此可见，施氮水平对烤烟叶片硝酸还原酶活性是有影响的，并且在一定范围内随施氮水平的提高硝酸还原酶活性逐渐升高。
从差异性分析来看，在30、45、60、75、90 d内，各生育期内随施氮水平上升硝酸还原酶活性均表现出差异性。不仅如此，N5组在30、75 d时硝酸还原酶活性与其余各组差距均达到显著水平，在45 d和60 d除与N4差异不显著外，与其余各组也呈现显著性差异，说明施氮水平的高低对烤烟叶片中硝酸还原酶活性的影响具有显著性。
2.2 不同施氮水平对烤烟叶片丙二醛含量的影响
由图2可以看出，在相同生育期内，丙二醛（MDA）含量为CK>N1>N2>N3>N4>N5，同时在30、45、60、75、90 d内各施氮水平间均达到差异水平。而施氮量较高的N3、N4、N5组丙二醛含量与施氮量较少的N1、N2和不施氮肥的CK组丙二醛含量差异显著。因此，为了烤烟更好地生长，提高烤烟抗逆性和抗衰老性，在种植时应适当提高施氮量。
2.3 不同施氮水平对烤烟叶片超氧化物歧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶（SOD）是生物抗氧化酶类的重要成员，其可催化超氧阴离子自由基的分解，是清除活性氧危害的第一道防线[6-7]。烤烟叶片中超氧化物歧化酶活性的高低能影响自身清除有害物质的能力，标志着叶片的衰老程度。由图3可以看出，随着烤烟生育期的进行，大田烤烟叶片中超氧化物歧化酶活性先升高后降低，其活性在烤烟移栽后60 d达到最大值。在同一生育期内，不同施氮水平的烤烟叶片超氧化物酶活性随施氮量的升高而增加，总体表现为CK<N1<N2<N3<N4<N5，在空白（CK）和低氮素水平（N1）下，超氧化物歧化酶活性差异性不显著，但随着施氮量的增加（N2～N5），超氧化物酶活性均与无氮（CK）和低氮素水平（N1）呈显著性差异。这表明在低氮素水平下，氮肥虽然能使超氧化物歧化酶活性增加，但对其的影响较小;而随着施氮量的增加，氮肥达到中低氮水平以上，氮素能大幅提高烤烟超氧化物酶活性，之后随着烟株的衰老活性逐渐下降。
2.4 不同施氮水平对烤烟叶片过氧化物酶活性的影响
过氧化物酶（POD）是生物抗氧化酶类的另一重要成员。由图4可以看出，在大田烤烟生长发育过程中，6个处理均表现出叶片中过氧化物酶活性随生育期的延长呈下降趋势，在成熟期活性很小。在相同生育期内，由于施氮水平的不同，过氧化物酶活性有所不同，随着施氮水平的上升，过氧化物酶活性增高，总体表现为CK<N1<N2<N3<N4<N5。通过差异性检验结果可以看出，在各生育期内各施氮水平下过氧化物酶活性均表现出一定的差异性，同时在30、45、60 d各组过氧化物酶活性均达到差异性显著，说明在一定施氮范围内，过氧化物酶活性与施氮水平成正相关。
3 结论与讨论
大量研究证明，烤烟的不同氮素供应形态、不同施氮水平、不同的农艺管理措施、植烟土壤等均会对烤烟叶片硝酸还原酶活性产生影响[8-10]。不仅如此，同一烟株的不同生育期、不同部位也会有所差别，这主要与基因的表达与硝酸还原酶的分布有关[11]。
在正常的生理代谢条件下，生物体内会有活性氧（ROS）的产生。活性氧产生的主要途径是氧分子进行单电子还原形成超氧阴离子的自由基，再通过其他途径形成活性氧[12-13]。活性氧不仅对蛋白质和核酸产生破坏作用，还会引发细胞膜中不饱和脂肪酸发生膜脂过氧化作用导致膜的分解，破坏膜的结构，同时产生丙二醛（MDA），丙二醛含量过高，则表明植物受损严重，抗氧化性和抗衰老性较差[14-16]。丙二醛作为植物生理的一个重要指标，人们长期以来从未放弃对它的研究，而将其运用到对烤烟生理生化水平的检测，能更好地明确烤烟的生长状况。
自由基衰老学说认为，植物老化的过程就是活性氧代谢失衡，导致活性氧的累积从而危害自身是植株走向衰老的过程[17-18]。过氧化物酶（POD）对过氧化氢有较高的亲和力，能催化底物与过氧化氢的反应，从而清除超氧化物歧化酶分解等代谢过程产生的过氧化氢，清除使植株走向衰老的活性氧等物质[19]。
研究结果显示，在整个生育期内，大田烤烟叶片硝酸还原酶活性总体上呈先上升后下降的趋势，并在烤烟移栽后60 d左右达到最大值，而在相同生育期内硝酸还原酶活性随施氮水平的提高而增加，在最大氮素水平75 kg/hm2时达到最大，说明在15～75 kg/hm2施氮范围内，75 kg/hm2左右最适合烤烟生长发育和代谢及合成有机物。丙二醛含量在生长发育过程中不断积累升高，并受施氮水平的抑制，在75 kg/hm2施氮水平下丙二醛含量最低。
对超氧化物歧化酶和过氧化物酶而言，超氧化物歧化酶活性随生育期进行先升高后下降，并随施氮水平的提高而有所上升;过氧化物酶活性随生育期进行不断降低，也随施氮水平的增加而升高，两者在烤烟生长发育后期活性都迅速下降。
对比硝酸还原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性可以发现，在75 kg/hm2的施氮水平下，烤烟发育的旺长期，丙二醛含量适宜，硝酸还原酶活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性都具有较高的水平;而在烟叶成熟期，丙二醛含量低，硝酸还原酶活性、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性都迅速下降，处于较低的水平。
本试验通过对15～75 kg/hm2施氮水平下大田烤烟叶片硝酸还原酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性等相关参数的研究，得出以下结论：
一是在15～75 kg/hm2施氮水平范围内烤烟生长发育过程中，硝酸还原酶活性先升高后下降，丙二醛含量逐渐升高，超氧化物歧化酶活性先升高后降低，過氧化物酶活性逐渐下降。二是在15～75 kg/hm2的施氮水平下烤烟相同生育期内，硝酸还原酶活性、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性随施氮水平的提高逐渐升高，丙二醛含量随施氮水平的提高逐渐下降[20]。
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