蓝莓角鲨烯环氧化酶基因的克隆与表达分析
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摘要：角鲨烯环氧化酶（SQE）催化角鲨烯合成三萜类骨架β-香树酯前体2，3氧化鲨烯，是熊果酸合成途径中的重要限速酶。本研究采用RT-PCR 技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQE基因，全长序列1 744 bp，序列分析结果表明，其含有1 620 bp开放阅读框，编码539个氨基酸;氨基酸同源序列分析表明，蓝莓与其它物种SQE蛋白氨基酸序列相似性很高，与山茶科的茶相似性最高，达90.6%，与猕猴桃相似性为89.7%;不同植物SQE蛋白序列分析发现，该类植物SQE含有3个保守结构域，均在VcSQE中存在;荧光定量试验表明，VcSQE基因在叶中表达量最高，根中表达量最低。
关键词：蓝莓;角鲨烯环氧化酶基因;生物信息学分析;荧光定量
中图分类号：S663.9：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）10-0001-07
Cloning and Expression Analysis of a SQE Homologous Gene from
Blueberry（Vaccinium corymbosum L.）
Chen Xin， Xu Li， Zhang Lisi， Zong Xiaojuan， Wei Hairong， Wang Jiawei， Tan Yue，
Zhu Dongzi， Hong Po， Liu Qingzhong
（Shandong Institute of Pomology/Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Tree Biotechnology， Taian 271000， China）
Abstract Squalene epoxidase （SQE） catalyzes the synthesis of triterpenoid β-fragrant resin precursor 2，3 squalene. It is an important rate-limiting enzyme in the ursolic acid synthesis pathway. The VcSQE gene was cloned from the Xilai blueberry root by RT-PCR with the full-length sequence as 1 744 bp. The sequence analysis showed that its open reading frame was 1 620 bp，and it encoded 539 amino acids. The amino acid homologous sequence analysis showed that the amino acid sequence of SQE protein in Vaccinium corymbosum L. was very similar to others. The highest similarity was 90.6% with that of tea in Camellia， and the similarity with Actinidia chinensis var. chinensis was 89.7%. Plant SQE had 3 conserved domains， and they were all present in VcSQE. The fluorescence quantitative experiments showed that the VcSQE gene had the highest expression in blueberry leaves and the lowest in roots.
Keywords Vaccinium corymbosum L.; Squalene epoxidase（SQE）;Bioinformatic analysis;Fluorescence quantitative
蓝莓作为一种高营养和高市场价值的水果，在中国的栽培面积和栽培种类日趋增多，而伴随蓝莓采后加工工艺的研发和优化，市场需求量越来越高[1-5]。蓝莓含有水果中普遍存在的营养物质糖、酸、矿物元素等，同时也含有大量尼克酸、黄酮等[6-8]。此外，还含有三萜类物质熊果酸和齐墩果酸[9]。
熊果酸（ursolic acid， UA）是存在于植物中的五环三萜类化合物，以游离酸或皂苷的糖苷配基形式存在。已被证实存在于许多药用植物中，如枇杷、粳稻、迷迭香、白花蛇舌草，苹果、梨和李子的蜡层中也发现有熊果酸存在[10]。因其具有一定的生物活性和低毒特性，现已成为许多生命科学领域研究的热点。已有研究证明熊果酸具有抗肿瘤、保肝、消炎等多种功效，能够抵抗多种致癌及促癌物[11]，并在抗氧化、拮抗微生物、降低血脂、镇痛、保护心血管、抗动脉粥样硬化和免疫调节等方面发挥作用[12，13]。另外，Kunkel等[14]研究发现，一些熊果酸可以增加骨骼肌Akt活性，并刺激非肥胖小鼠的肌肉生長;Close等[15]提出熊果酸能够通过抑制肌肉萎缩基因以及增强胰岛素和IGF-I信号途径来增加肌肉量，可以作为运动补剂;De Almeida等[16]认为熊果酸应用于化妆品中可起到促进皮肤表皮细胞更新、抗刺激、抗菌作用。
三萜类化学物质的合成主要依赖类异戊二烯代谢途径[17]。两分子的法尼基焦磷酸在鲨烯合酶的催化下，生成一分子鲨烯[18]，生成的鲨烯在角鲨烯环氧化酶（SQE）催化下形成2，3-氧化鲨烯，2，3-氧化鲨烯作为三萜类物质骨架β-香树酯的直接前体物质对三萜类物质的合成具有十分重要的意义[19]。所以，对控制鲨烯环氧化酶合成的SQE基因的研究显得尤为重要，有助于我们在分子水平上利用基因工程手段实现三萜皂苷的规模化生产。
角鲨烯环氧化酶在大多数植物体内以多拷贝形式存在，因此SQE基因以基因家族的形式存在。拟南芥中确定了6种假定的角鲨烯环氧化酶，在酵母中通过异源表达证明其中3种酶SQE1、SQE2和SQE3的催化功能。科研人员发现拟南芥sqe1突变体存在严重的发育缺陷，根系生长较弱，并且下胚轴伸长受限;成熟拟南芥sqe1-3、sqe1-4突变体株高降低，种子无法存活;sqe1-3突变体积累角鲨烯。因此，SQE1对于植物正常生长发育是必要的，拟南芥突变体中剩余的5个SQE1样基因与SQE1并非完全冗余，可能存在协同作用或其它作用[20]。研究发现，印度楝（Azadirachta indica）中有6种SQE基因，且6种基因在根和叶中均有差异表达[21]，而吊兰（Chlorophytum borivilianum）仅在叶中CbSE表达量较高[22]。
本研究试图从蓝莓根中克隆SQE基因并进行相关生物信息学分析，同时，利用qRT-PCR检测蓝莓不同组织中的SQE基因相对表达情况，以期为探明角鲨烯环氧化酶在不同物种间的保守性及进化关系和进一步探究SQE基因表达与三萜皂苷类含量的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用试材‘喜来’蓝莓根取自山东省果树研究所泰东苗圃基地。取材后用液氮速冻，-80℃保存备用。
1.2 总RNA的提取和cDNA的合成
利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA提取试剂盒提取蓝莓根RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带的完整性。将提取后的RNA参照abmgood 5X All-In-One RT MasterMix 反转录试剂盒说明书步骤进行反转录，并将得到的cDNA-20℃保存备用。
1.3 VcSQE基因的克隆
根据已知其它植物SQE基因设计获得VcSQE基因全长序列的特异性引物（表1），对cDNA产物进行目的片段扩增。PCR反应体系20 μL：cDNA 0.5 μL，上下游引物F、R各0.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA Poly-merase 0.1 μL，5×Buffer 4 μL，补水至终体积为20 μL。反应程序：94℃预变性3 min;98℃变性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸90 s，35个循环; 72℃延伸5 min。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳检测，拍照并记录试验结果。再使用 OMEGA公司的凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，并将目的基因连接到克隆载体pTOPO-Blunt上，转化、筛菌后送擎科生物科技有限公司测序。
1.4 生物信息学分析
将序列通过NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blast比对分析，下载其它物种序列，并利用DNAMAN软件进行不同物种氨基酸序列同源性分析，后利用MEGA 7.0构建系统进化树。通过Pfam（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）和MEME（http：//meme-suite.org/）进行蛋白保守结构与分析。
1.5 VcSQE基因组织表达特性
所用VcSQE基因的qRT-PCR引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBR GREEN进行qRT-PCR，反应体系20 μL：模板2 μL，正反向引物各0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。利用ABI 7500 荧光定量仪采用两步法进行PCR扩增，反应程序：95℃ 120 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，循环40次后进行熔解曲线分析。每样品重复3次，采用2-ΔΔCT的计算方法分析相对表达量。以蓝莓青果的表达量为对照。
2 结果与分析
2.1 VcSQE基因的克隆
以蓝莓根系为材料提取总RNA反转录获得cDNA，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测，获得1 700 bp左右的特异性条带（图1），与预期结果一致，初步判断得到VcSQE基因。将PCR体系扩至40 μL，使用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，再次电泳，得到与图1大小一致的条带（图2）。
2.2 VcSQE基因序列分析
利用RT-PCR 和RACE 技术从蓝莓根中成功克隆VcSQE基因，序列全长为1 744 bp，其开放阅读框为1 620 bp，编码539个氨基酸（图3）。
2.3 VcSQE的同源序列分析
使用DNAMAN软件对推导的蓝莓VcSQE与其它物种的SQE氨基酸序列进行同源性分析，结果（图4）显示，蓝莓与猕猴桃SQE的同源性为897%，与月季的同源性最低，仅为80.7%，与另外9种植物的同源性均在80%以上，其中与茶的同源性高达90.6%。总体而言，蓝莓与所参考的植物中14种SQE蛋白的氨基酸序列相似性較高。
2.4 VcSQE的系统进化分析和蛋白保守结构域分析
为明晰蓝莓与其它11种植物SQE之间的进化关系，借助MEGA 7.0软件，在多重比较的基础上， 用最大似然法将不同植物的14种SQE蛋白氨基酸序列构建系统进化树。结果（图5）显示，蓝莓VcSQE与猕猴桃SQE为一个类群，亲缘关系最近，与茶的亲缘关系也较近;与其它种属植物的亲缘关系稍远。这表明SQE基因具有种属特异性。
通过Pfam（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）查询到蓝莓VcSQE蛋白序列的4个保守功能结构域，如表2所示。同时，在MEME（http：//meme-suite.org/）中找到了15个SQE植物蛋白序列中3个高度保守结构域，其在蓝莓VcSQE中的位置为（122～171、323～372、388～437 aa），通过与表2中保守功能结构域位置结合分析可知NAD_binding_8位点在VcSQE中具有特异性，而保守结构域2（Motif 2）蛋白序列包含于SE（214～487 aa）活性功能区，可能是植物SQE发挥酶活性的必需序列。
2.5 VcSQE基因在不同组织中的相对表达量分析
本试验分别提取蓝莓青果、紫果、花、叶、芽、根的总RNA，反转录得到cDNA，并利用荧光定量分析不同组织中VcSQE基因的表达情况。由图6可以看出，不同组织中VcSQE基因相对表达量由高到低依次为叶、花、紫果、青果、芽、根。
3 讨论与结论
三萜类化合物具有重要的环境效应和良好的经济价值，因此研究次生代谢产物合成的基因调控成为热点领域。而角鲨烯环氧化酶SQE在三萜类化合物合成途径中发挥着重要作用，是上游代谢通路中的一个关键酶。基于此，本研究以‘喜来’蓝莓品种为试材，成功从根中克隆VcSQE基因，序列分析结果表明，VcSQE基因具有1 620 bp开放阅读框，编码539个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，蓝莓与其它物种SQE蛋白氨基酸序列相似性很高，与山茶科茶的相似性最高，达90.6%，与猕猴桃的相似性达到89.7%。系统进化树表明蓝莓VcSQE与猕猴桃SQE为一个类群，同源序列比对结果和系统进化树得到的结论一致。多种植物SQE蛋白序列分析结果表明，植物SQE含有3个保守结构域，均在VcSQE中存在。荧光定量技术检测结果表明，VcSQE基因在蓝莓叶、花、紫果、青果、芽、根组织器官中均有表达，叶中的表达量最高，根中最低，且紫果中的表达量高于青果。因此，可利用基因工程技术使SQE基因得到高效表达，一定程度上可能有助于提高三萜类物质的合成。本研究对解释三萜类物质在不同组织的差异性分布以及在蓝莓不同组织中的功能具有一定的参考意义。
参 考 文 献：
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收稿日期：2019-05-22
基金項目：国家自然科学基金项目（31500248）;山东省农业科学院青年基金项目（2015YQN35）;山东省现代农业产业技术体系果品产业创新团队专项基金项目（SDAIT-06-04）
作者简介：陈新（1980—），男，山东泰安人，博士，副研究员，研究方向：果树种质资源与生物技术育种。E-mail：63249324@qq.com
通讯作者：刘庆忠（1963—），男，山东莒南人，博士，研究员，主要从事果树生物技术与资源育种研究。E-mail：qzliu001@126.com