基于TG酶凝固的大豆蛋白凝胶生产工艺研究
摘要：以大豆分离蛋白为原料，研究谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TG酶）生产大豆蛋白凝胶工艺的条件。通过单因素试验确定初始pH值、反应温度、TG酶添加量和反应时间，以凝胶保水性和水分含量为指标，采用正交试验设计进行优化。结果表明，TG酶生产大豆蛋白凝胶最佳工艺条件为大豆蛋白溶液初始pH值5.0，反应温度55 ℃，TG酶添加量0.5%，反应时间20 min。在此条件下制备得到的凝胶保水性为78.21%，水分含量为84.35%。根据凝胶品质相关性分析和主成分分析，确定硬度和咀嚼性是影响大豆蛋白凝胶品质的主要因素。
关键词：大豆蛋白凝胶;谷氨酰胺转氨酶（TG酶）;保水性;水分含量;质构特性
中图分类号：TS201.2 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.07.042
Abstract：In this research，soybean protein isolated was used as raw material，studied on soybean protein gel production process curd by TGase. The initial pH，reaction temperature，TGase dosage and reaction time were taken as single factors. The water retention and water content of gel were taken as indicators. Orthogonal experimental design was used to optimize the conditions. The results showed that the optimized conditions for TGase to curd soybean protein were determined as follows：soybean protein initial pH 5.0，reaction temperature 55 ℃，TGase dosage 0.5%，reaction time 20 min. Under those conditions，water retention was 78.21%，water content was 84.35%. According to the correlation analysis of soybean protein gel quality and principal component analysis，the hardness and chewiness were the main factors.
Key words：soybean protein gel;Transglutaminase（TGase）;water retention;water content;texture characteristics
谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，简称TG酶）是一种催化酰基转移反应的转移酶，蛋白质和肽键中谷氨酞胺残基的γ -羧酰胺基为酞基供体[1-2]。不同来源的原料TG酶处理条件不一样，如鱼肉TG酶最适pH值7.5，最适温度30 ℃;豚鼠肉TG酶最适pH值6.0，最适温度50～65 ℃;微生物TG酶最适pH值6.0～7.0，最适温度50 ℃[3-6]。目前，TG酶在肉制品、乳制品和植物蛋白制品加工及环保型胶黏剂等多方面均有应用[7-8]。在豆制品生产中常以TG酶作为凝固剂。
蛋白质经过解离、变性，暴露出用于分子间交联的功能基团，在合适的条件下，相邻的蛋白分子通过化学作用力结合到一起形成三维网络结构，成为凝胶[9-10]。凝胶作用是蛋白质最重要的加工功能性质之一[11]，豆腐便是经过大豆蛋白凝胶加工而成[12]，加热、酸、盐和酶均可诱导形成大豆蛋白凝胶。大豆蛋白的主要蛋白组成是球蛋白，包括大豆豆球蛋白（glycinin）和以主要7S球蛋白[13-16]形式存在β -伴大豆球蛋白（β-conglycinin）。大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量不仅是豆腐的品质指标[17]，还是反应大豆蛋白的凝固状态、决定最终豆腐的质构特性。试验以大豆蛋白凝胶保水性、水分含量和质构特性为指标，研究TG酶对大豆蛋白凝固特性的影响，探讨TG酶对大豆蛋白凝胶品质的影响，为TG酶在豆制品中的应用提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
大豆蛋白、TG酶，湖南君益福食品有限公司提供;氢氧化钠标定液、酚酞、乙醇溶液、戊烯二醛溶液、OsO4溶液，均为分析纯。
1.2 仪器与设备
台式冷冻离心机，澳大利亚达卡米公司产品;LS型质构仪，美国阿美特克有限公司产品;MJ33型水分自动测定仪，梅特勒-托利多公司产品。
1.3 试验方法
1.3.1 凝胶制备
配制4%大豆蛋白溶液[18]，调节初始pH值，于95 ℃下水浴加热10 min，冷却至一定反应温度加入TG酶，控制反应时间。
1.3.2 单因素试验
（1）初始pH值条件试验。分别调节大豆蛋白溶液初始pH值至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，固定反应温度50 ℃，TG酶添加量0.2%，反应时间15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响
（2）反应温度试验。调节大豆蛋白溶液初始 pH值至5.0，分别设置反应温度40，45，50，55， 60 ℃，固定TG酶添加量0.2%，反应时间15 min，探究反应温度对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。
（3）TG酶添加量试验。调节大豆蛋白溶液初始 pH值至5.0，设置反应温度50 ℃，使TG酶添加量分别为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，反应时间15 min，探究大豆蛋白溶液初始pH值对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。
（4）反应时间试验。调节大豆蛋白溶液初始 pH值至5.0，设置反应温度50 ℃，固定TG酶添加量0.4%，控制反应时间分别为10，15，20，25， 30 min，探究大豆蛋白反应时间对凝胶保水性、水分含量及质构特性的影响。
1.3.3 正交试验
以单因素试验结果为基础，选择初始pH值（A）、反应温度（B）、TG酶添加量（C）和反应时间（D）4个因素进行四因素三水平正交优化试验，通过保水性和水分含量选出TG酶凝固条件最佳工艺 组合。
1.3.4 凝胶腐保水性测定[19]
称取3 g（精确到0.000 1 g）凝胶样品放置于底部垫有脱脂棉的离心管中，以转速1 200 r/min离心10 min，离心后称量上层凝胶的质量（W1），此后将此样品置于105 ℃下干燥至恒质量（W0）。持水率计算公式为：
持水率= ■×100%.
1.3.5 凝胶水分含量测定
称取2 g样品放置于水分自动测定仪，测定完成后记录数据。
1.3.6 凝胶质构特性测定[20]
取凝胶中心部分切成长宽高分别1 cm正方体的样品，采用二次压缩方法测定质构。用P35圆柱形平底探头，测前、测中、测后速度分别40，30，40 mm/s，下压距离40%，停留时间5 s，触发力0.05 N。同一个样品选3个不同部分进行测试，取平均值。
1.4 数据分析
采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行相关性分析和主成分分析。
2 结果与分析
2.1 初始pH值试验
初始pH值对凝胶保水性和水分含量的影响见图1，初始pH值对凝胶质构特性的影响见图2。
如图1所示，随着初始pH值的增大，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量均呈先上升后下降的趋势，在pH值5.0时有最大值，变化显著。大豆蛋白在等电点（pH值4.2～4.6）附近迅速聚集沉淀，蛋白质分子之间有序性降低[21]。蛋白质分子可能更容易与水分子结合，进而包裹更多水分子。在TG酶的作用下大豆蛋白质分子内或分子间交联作用加强，凝胶结构紧密，保水性提高，水分含量增大。TG酶的最适pH值为5～8时有较高活性，过于酸性的环境会使TG酶活性降低，从而降低TG酶与大豆蛋白分子之间的交联作用，不利于大豆蛋白分子与水分子的结合。由图2可知，硬度和咀嚼性随着初始pH值的增大呈先增大后减小的趋势，在初始pH值5.0时有最大值;弹性和内聚性变化趋势不规律，在初始pH值4.5时有最大值。初始pH值与质构指标硬度、咀嚼性和内聚性有显著性差异（p<0.05），与弹性无显著性差异。
2.2 反应温度对凝胶品质的影响
反应温度对凝胶保水性和水分含量的影响见图3，反应温度对凝胶质构的影响见图4。
如图3所示，随着反应温度的升高，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量变化一致，均呈先上升后下降的趋势，在55 ℃时为最大值，变化显著。大豆蛋白预先在95 ℃下水浴加热10 min保证变性充分（蛋白质解热温度过高会发生热降解，从而使蛋白质失去凝胶能力），使蛋白质的巯基基团及疏水区域大部分暴露出来[22]，加入TG酶后更容易发生交联作用，大豆蛋白凝胶结构紧密，保水性好，水分含量高。TG酶的最适温度在45～55 ℃，温度过高TG酶活性下降，与蛋白质的交联作用减弱，形成的凝胶结构部松散、保水性低。由图4可知，硬度和咀嚼性随着反应温度的上升呈先增大后减小的趋势，在反应温度45 ℃时为最大值;弹性和内聚性变化趋势不规律，在反应温度50 ℃时为最大值。反应温度与质构指标硬度、咀嚼性、弹性有显著性差异（p< 0.05），与内聚性无显著性差异。
2.3 TG酶添加量对凝胶品质的影响
TG酶添加量对凝胶保水性和水分含量的影响见图5，TG酶添加量对凝胶质构的影响见图6。
如图5所示，随着TG酶添加量的增大，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量先缓慢上升，在0.4%有最大值，随后下降，变化显著。大豆蛋白稳定的空间结构由于TG酶发生交联作用变得不稳定，暴露出的大量疏水區域在疏水作用下进一步交联聚集，从而形成凝胶。但Sakamoto H等人[23]研究发现，随着TG酶添加量的增大，大豆蛋白质分子表面的作用位点可能很快被交联而降低了TG酶与蛋白分子交联的几率[24]，从而形成的蛋白质分子间凝胶结构少而松散。松散的结构使蛋白凝胶的保水性相对降低，水分含量减少。由图6可知，硬度和咀嚼性随着TG酶添加量的增大呈先增大后减小的趋势，在TG酶添加量0.4%时有最大值;弹性和内聚性变化趋势不规律，在TG酶添加量0.5%时弹性有最大值。TG酶添加量与质构指标硬度和咀嚼性有显著性差异（p<0.05），与弹性和内聚性无显著性差异。
2.4 反应时间对凝胶品质的影响
反应时间对凝胶保水性和水分含量的影响见图7，反应时间对凝胶质构的影响见图8。
如图7所示，随着反应时间的增加，大豆蛋白凝胶的保水性和水分含量先上升后下降，在20 min有最大值，變化显著。充分的反应时间使TG酶催化蛋白质分子上酰基转移完全，交联作用加强凝胶结构趋于稳定紧密，保水性增大、水分含量增多。但Howell N K[25]的研究结果表明，凝固时间过长会使蛋白质分子上的巯基发生氧化，进而疏水作用减弱导致凝胶结构松散，保水性减小、水分含量减少。由图8可知，硬度和咀嚼性随着反应时间的增加呈先增大后减小的趋势，在反应时间20 min时为最大值;弹性和内聚性变化趋势不规律，在反应时间25 min时为最大值。反应时间与质构指标硬度和咀嚼性有显著性差异（p<0.05），与弹性无显著性差异。
2.5 正交试验
正交试验设计与结果见表1。
采用极差分析法，对各因素均值及极差大小进行分析。由表1可知，TG酶凝固大豆蛋白的4个条件对凝胶的保水性和水分含量影响程度相同，主次顺序均为C>A>B>D，即TG酶添加量>初始pH值>反应温度>反应时间，即最优组合为A2B2C3D2，按 此组合进行验证试验，结果表明，A2B2C3D2组合下凝胶保水性为78.21%，水分含量为84.35%，结构紧致，故A2B2C3D2组合为最优组合，即初始pH值5.0，反应温度55 ℃，TG酶添加量0.5%，反应时间20 min。
2.6 凝胶品质相关性分析
采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行相关性分析。
凝胶品质相关性分析见表2。
根据表2进行凝胶品质相关性分析，保水性与水分含量呈极显著正相关（r为0.785），即保水性越大凝胶水分含量越高，这是因为水分与蛋白网络结构紧密结合不易流失;保水性与硬度和咀嚼性呈极显著正相关（r分别为0.639，0.581），即保水性越大凝胶的硬度和咀嚼性越大，这是因为蛋白网络空间结构包裹较多的水分导致硬度和咀嚼性增大。水分含量与硬度和咀嚼性呈极显著正相关（r分别为0.653，0.581），即水分含量越高硬度和咀嚼性越好，这是因为水分含量会直接影响凝胶强度，进而影响凝胶的硬度和咀嚼性。硬度与咀嚼性、弹性和内聚性呈极显著正相关（r分别为0.901，0.551，0.835），即硬度越大，咀嚼性、弹性和内聚性越好;咀嚼性与弹性和内聚性呈极显著正相关（r分别为0.659， 0.653），即咀嚼性越大，弹性和内聚性越好;弹性与内聚性呈显著正相关（r为0.489），即弹性越大，内聚性越好。质构特性影响凝胶强度和蛋白质网络空间结构，进而质构特性间相互影响。
2.7 凝胶品质主成分分析
采用SPSS 22.0数据处理软件对数据进行主成分分析。
凝胶品质主成分分析见表3。
对凝胶品质进行主成分分析（principal components analysis，PCA），表3通过方差分解提取出2个主成分。第一主成分方差累积值能解释凝胶品质信息的64.639%，第二主成分方差累积值能解释凝胶品质信息的18.760%，一共反映了凝胶品质绝大部分信息83.399%。
主成分矩阵见表4。
根据表4主成分矩阵分析，第一主成分与硬度和咀嚼性呈显著性相关（相关系数r分别为0.965和0.922），且第一主成分可解释凝胶品质信息的大部分，因此硬度和咀嚼性是决定凝胶品质的关键因素。
3 结论
传统豆清发酵液生产条件与TG酶作用大豆蛋白的条件范围有差异，试验确定了TG酶凝固大豆蛋白的最优条件为初始pH值5.0，反应温度55 ℃，TG酶添加量0.5%，反应时间20 min。通过对大豆蛋白凝胶品质进行相关性分析发现，除了硬度与弹性呈显著相关，硬度和咀嚼性均与其他指标均呈极显著相关;质构特性之间相关性十分复杂。通过主成分分析，确定硬度和咀嚼性是影响大豆蛋白凝胶品质的关键因素。
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