酶法酯交换制备食品专用油脂的研究
摘要：以牛油、茶籽油和棕榈硬脂为基本原料，通过特异性固定化脂肪酶Lipozyme RM IM催化制备零反式脂肪酸食品专用油脂基料油。在单因素试验基础上进行Box-Behnken响应面试验设计，考查了底物比、酶添加量、反应时间和反应温度对产物滑动熔点的影响，建立了响应面回归模型，确定了酶催化酯交换反应的最优条件为底物比7.55∶2.45∶4.00（牛油∶茶籽油∶棕榈硬脂），酶添加量3.65%，反应时间3.85 h，反应温度72.6 ℃，所得产物滑动熔点为36.8 ℃，与理论值37 ℃接近，误差<1%，与酯交换反应前相比，经酯交换反应后产物油脂的固体脂肪指数降低，可作为良好的替代氢化油的人造奶油基料油。
关键词：酯交换油脂；酶催化；牛油；茶籽油
中图分类号：TS224 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2018.08.035
Synthesis of Interesterification Special Oils by Enzymatic Catalysis
ZHENG Donglei1，GE Yuanfei1，YI Jianfeng1，*PANG Min1，2
（1. School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009，China；
2. The Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province，Hefei，Anhui 230009，China）
Abstract：The interesterified oil with trans-free fatty acid were synthesized by interesterification of beef tallow，camellia oil and palm stearin using specific immobilized lipase Lipozyme RM IM. The Box-Behnken response surface experiment was designed on the basis of single factor experiments. The effects of substrate ratio，enzyme concentration，reaction time，and reaction temperature on the sliding melting point were investigated. A response surface regression model was established to determine the optimum conditions for the enzymatic interesterification were as follows：the ratio of substrate was 7.55∶2.45∶4.00（beef tallow∶camellia oil∶palm stearin），in the concentration of 3.65% Lipozyme RM IM，reaction 3.85 h at 72.6 ℃. Under these condition，the sliding melting point was 36.8 ℃，which is close to the theoretical value of 37 ℃ and the error was less than 1%. In addition，the solid fat index of interesterified oil was greatly reduced as compared with blend oil demonstrate that it could be utilized as a good substitute for hydrogenated oil in food industry.
Key words：interesterification oil；enzymatic catalysis；beef tallow；camellia oil
近年来，心血管疾病、肥胖病、动脉粥样硬化等疾病的发病率逐年上升，而反式脂肪酸（TFA）的存在则是引起这一系列疾病的主要因素之一[1-4]。TFA广泛存在于人造奶油、起酥油、类可可脂等“部分氢化植物油”，源于其生物氢化、油脂氢化及热处理工艺过程[5-7]。FDA已于2015年将“部分氢化植物油”移出GRAS名單，近期将在食品行业全面禁用“部分氢化植物油”。研究开发营养健康、塑性优良的不含反式脂肪酸专用油脂，对丰富食品专用油脂种类，保障人造奶油行业健康发展具有重要的应用价值。
酶催化酯交换是利用生物酶为催化剂进行的酯交换反应，是一种可以生产具有特殊性能油脂的改性方法，其原理是通过引起酰基的重新分布、甘油三酯中脂肪酸的重排来改变油脂的理化性质[8]。相比于传统化学酯交换，酶催化酯交换技术能有目的性地实现甘油基上不同脂肪酸位置重排，从而完成油脂的改性，近些来得到了较广泛的研究，Kowalska D等人[9]以牛油硬脂和菜籽油为原料进行酯交换油脂与其物理混合油脂对比，得出酯交换油脂具有较低的固体脂肪含量和良好的抗氧化特性。Zhu T等人[10]采用酶法催化棕榈硬脂和大豆油来制取速冻食品特种油脂，得出酯交换后油脂的固体脂肪含量有所下降，结晶主要为β"晶型，是理想的速冻食品专用脂肪。
茶籽油是我国特有的木本油脂，含有丰富的必需脂肪酸、亚麻酸，具有和橄榄油类似的高油酸含量，富含VE、角鲨烯等，被誉为“东方橄榄油”[11]。牛油具有植物油脂所不可比拟的风味物质、特殊营养、固脂含量和起酥性能，但牛油基产品易起砂，破坏产品的柔软性，而通过酯交换可以很好地提高以牛油为基料的混合油脂使用性能[12-15]。试验采用酶催化酯交换技术，开展以牛油、茶籽油和棕榈硬脂为原料的不含反式脂肪酸专用油脂制备工艺的研究，利用响应面法优化酯交换反应条件以得出最优工艺参数。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛油，重庆帅克食品有限公司提供；一级茶籽油，安徽舒城华银茶叶有限公司提供；棕榈硬脂，广州天意化工集团有限公司提供；Lipozyme RM IM，诺维信公司提供；正己烷、甲醇、异丙醇，均为色谱纯；无水乙醇、无水硫酸钠，均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Heizbad Hei-VAP型旋转蒸发仪，德国Heizbad公司产品；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；Q200型差示扫描量热仪，美国TA仪器公司产品。
1.3 试验方法
1.3.1 酯交换油脂的制备
将牛油、棕榈硬脂加热融化后按照一定的质量比（牛油、茶籽油、棕榈硬脂）加入到圆底烧瓶中，摇匀后加入一定比例的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，设定旋转蒸发仪转速为70 r/min，抽取真空，恒温反应一定时间，待反应结束后及时去除固定化脂肪酶，醇洗去除游离脂肪酸和单甘脂等杂质，旋蒸去掉残余的乙醇，得到酯交换产物即酯交换油脂。
1.3.2 滑动熔点的测定
根据AOCS Official Method Cc 3-25方法测定酯交换油脂的滑动熔点[12]。
1.3.3 固体脂肪指数（SFI）测定
利用油料油脂检测与分析法测定油酯的固体脂肪指数[13]。
1.3.4 酯交换油脂制备工艺优化试验设计
设定底物比（牛油∶茶籽油∶棕榈硬脂）X1为5∶5∶4，6∶4∶4，7∶3∶4，8∶2∶4，9∶1∶4；酶添加量X2为2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%；反应时间X3为0，1，2，3，4，5 h；反应温度X4为50，60，70，80，90 ℃进行单因素试验。在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken试验设计原理，设计四因素三水平响应面试验，考查酶催化酯交换工艺参数对酯交换产物滑动熔点的影响。
响应面试验因素与水平设计见表1。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 底物比（牛油∶茶籽油∶棕榈硬脂）对酯交换油脂滑动熔点的影响
底物比分别设定5∶5∶4，6∶4∶4，7∶3∶4，8∶2∶4，9∶1∶4，在酶添加量3.5%，反应温度70 ℃条件下反应3.5 h。
底物比对酯交换油脂滑动熔点的影响见图1。
由图1可知，酯交换油脂的滑动熔点随着牛油所占比例的增大，滑动熔点逐渐升高，由5∶5∶4的32.5 ℃左右升高到9∶1∶4的39.4 ℃左右，大致呈正相关。当油脂滑动熔点近似于人体体温（37 ℃）时，油脂可以在口腔内完全融化，不会有蜡感和黏口感。综合考虑，选取最佳底物比为7∶3∶4。
2.1.2 酶添加量对酯交换油脂滑动熔点的影响
酶添加量分别设定2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，在底物比7∶3∶4，反应温度70 ℃条件下反应3.5 h。
酶添加量对酯交换油脂滑动熔点的影响见图2。
由图2可知，当固定化脂肪酶添加量低于3.5%时，随着酶添加量增加，酯交换反应体系的滑动熔点下降。这归因于反应底物与酶分子接触的几率大大增加，从而提高了酯交换反应的效率，降低了反应体系的滑动熔点。当酶添加量高于3.5%时，反应趋于平衡，反应体系的滑动熔点基本不变化。从经济效率等方面综合考虑，选取酶添加量3.5%进行后续优化试验。
2.1.3 反应时间对酯交换油脂滑动熔点的影响
反应时间分别设定0，1，2，3，4，5 h，在底物比7∶3∶4，酶添加量3.5%，反应温度70 ℃条件下反应。
反应时间对酯交换油脂滑动熔点的影响见图3。
由图3可知，当反应时间较短时，滑动熔点较高，随着反应时间的增加，滑动熔点逐渐降低，说明随着酯交换反应的进行，脂肪酸发生重排。当反应时间小于4 h时，滑动熔点下降较快；当反应时间大于4 h时，滑动熔点趋向于平缓，说明反应已经达到平衡，由于反应时间的延长会增加酰基的转移几率和副反应的发生，能耗也随之增加，所以综合考虑选取最佳的反应时间为3.5 h。
2.1.4 反应温度对酯交换油脂滑动熔点的影响
反应温度分别设定50，60，70，80，90 ℃，在底物比7∶3∶4，酶添加量3.5%，反應时间3.5 h条件下反应。
反应温度对酯交换油脂滑动熔点的影响见图4。
由图4可知，当反应温度较低（50～60 ℃）时，反应体系的滑动熔点比较高，即滑动熔点下降较少（未反应时滑动熔点43.0 ℃左右），则表明酯交换反应速率较缓，可能是当温度比较低的时候，酶活较低，催化效率低。当温度逐渐增加时，酶的催化效率逐渐升高；当反应温度大于70 ℃时，滑动熔点下降趋势平缓，并逐渐达到平衡，温度继续升高，滑动熔点不再下降，考虑到较高的温度可能会导致酶失活，增加甘油三酯的水解和酰基转移等副反应发生的几率。综合考虑，选取最佳反应温度为70 ℃。
2.2 响应面试验结果
根据Design Expert 8.0提供的模型，以底物比（X1）、酶添加量（X2）、反应时间（X3）、反应温度（X4）4个因素为自变量，以3次试验所测得酯交换产物滑动熔点的平均值为响应值（Y）。
响应面试验设计和结果见表2。
利用响应面分析软件进行多元回归拟合，以滑动熔点（Y）与底物配比、酶添加量、反应时间和反应温度之间建立的响应面回归模型如下：
Y=37.45+1.23X1-0.49X2-0.36X3-0.36X4+
0.087X1X2+0.012X1X3+0.025X1X4+0.21X2X3+
0.13X2X4+0.063X3X4+0.34X12-0.069X32+0.11X42.
对其试验数据结果进行方差分析。
响应面二次回归方程模型方差分析结果见表3。
通过响应面方差分析结果可以看出，X1，X2，X3，X4，X12对滑动熔点Y的影响都非常显著；X2X3对滑动熔点的比较显著，具有交互作用。模型整体拟合度非常显著（p<0.05），并且R2=98.16%，R2Adj=96.32%，预测性可达到90.70%，说明该模型的建立与试验拟合度良好，具有很高的可信度。
2.3 酯交换油脂制备最优工艺确定与验证
统计分析后，根据油脂滑动熔点接近于人体体温时可以在口腔内完全融化，不会有黏口感和蜡感，所以优化试验时以37 ℃为最优条件，得到最优酶催化酯交换反应条件为底物比7.55∶2.45∶4.00（牛油∶茶籽油∶棕榈硬脂），酶添加量3.65%，反应时间3.85 h，反应温度72.6 ℃。通过验证试验得到的油脂实际滑动熔点为36.8 ℃，与理论值较为接近，误差小于1%。
2.4 酯交换反应前后油脂的固体脂肪指数分析
酯交换反应前后油脂的固体脂肪指数见图5。
固体脂肪指数是衡量人造奶油等专用油脂品质的重要指标之一，它与油脂的涂抹性、口溶性和外观等有着密切的联系。由图5可知，油脂酯交换前后油脂的固体脂肪指数反生了明显变化，在10～ 40 ℃时，原料油脂经酯交换反应后，固体脂肪指数大大下降，说明经过酯交换反应高熔点甘油三酯含量大大降低，固体脂肪含量大大减少；在接近人体体温时，固体脂肪指数由原来的20%左右，降至5%左右，说明油脂在人口中几乎可以全部融化，增加了油脂的口感，极大地降低了油脂的粗糙感和砂粒感；同时在20～35 ℃内，固体脂肪指数曲线是一条陡峭的融化曲线，说明油脂在口中可以急剧融化，吸收热量给人一种清爽的口感，酯交换油脂是理想的食品专用油脂。
3 结论
通过单因素试验和响应面试验优化分析得到酶催化酯交换反应最优工艺条件为底物比7.55∶2.45∶4.00（牛油∶茶籽油∶棕榈硬脂），酶添加量3.65%，反应时间3.85 h，反应温度72.6 ℃。在最优反应条件下，酯交换油脂的滑动熔点近似于人体体温，固体脂肪指数较反应前大大降低，并对建立的模型进行了验证，证明其具有高可信度。酯交换反应后产物油脂的固体脂肪指数降低，可作为良好的替代氢化油的人造奶油基料油。
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