电针对偏头痛大鼠内源性大麻素及其分解酶活性的调控作用研究

摘要目的：研究电针对电刺激硬脑膜大鼠偏头痛内源性大麻素及其分解酶活性的调节作用。方法：成年雄性SD大鼠随机分为4组，对照组、模型组、单穴组和假穴组。实验第9天取大鼠颈静脉血清，用酶联免疫吸附测定测定AEA、2AG、MAGL、FAAH，结果：与模型组比较，单穴组AEA含量提高，差异有统计学意义（P<005），MAGL含量降低，差异有统计学意义（P<005）；与对照组比较，模型组AEA含量降低，差异有统计学意义（P<005），MAGL含量提高，差异有统计学意义（P<005）；与假穴组比较，单穴组AEA含量提高，差异有统计学意义（P<005），MAGL含量降低，差异有统计学意义（P<005）；各组大鼠血清FAAH和2AG含量无显著变化。结论：提示电针对偏头痛大鼠模型的内源性大麻素及其分解酶具有调节作用。

关键词针刺；偏头痛；大鼠；炎症汤；内源性大麻素；分解酶

Regulation Effects of Electroacupuncture on Endogenous Cannabinoid and Its Catabolic Enzyme Activity in Migraine Rats

Zhu Yupu1， Liu Lu2， Xu Xiaobai2， Qu Zhengyang2， Li Zhijuan1，2， Li Bin2， Wang Linpeng2

（1 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China）

AbstractObjective：To study the regulation effects of electroacupuncture on endogenous cannabinoid and its catabolic enzyme activity in migraine rats. Methods：Adult male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group， model group， single acupoint group and false acupoint group. Rat jugular vein serum was taken on the 9th day of the experiment， and AEA， 2AG， MAGL， FAAH were determined by enzymelinked immunosorbent assay. Results：Compared with the model group， the content of AEA in the single acupoint group was increased （P<005） and the content of MAGL was decreased （P<005）. Compared with the control group， the content of AEA in the model group decreased （P<005）， and the content of MAGL in the model group increased （P<005）. Compared with the sham acupoints group， the content of AEA in the single acupoint group was increased （P<005） and the content of MAGL was decreased in the single acupoint group （P<005）. The content of FAAH and 2AG in serum of rats in each group had no significant changes. Conclusion：It suggests that the endogenous cannabinoids and their degrading enzymes have a regulatory effect on the migraine rat model.

Key WordsElectroacupuncture； Migraine； Rats； Endogenous cannabinoid； Enzyme

中圖分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.040

偏头痛是一种病因不明、反复发作、致残性的神经功能紊乱疾病，发病时头部单侧搏动样中重度剧烈疼痛，同时伴有畏光畏声、恶心呕吐等症状[1]。据2017年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）全球疾病负担调查[2]显示，偏头痛的全球健康寿命损失年在所有疾病当中排名第3，在神经系统疾病失能调整生命年中占比131%，仅次于中风。随着研究的进展，人们对偏头痛的认识正逐步加深，但是偏头痛的发病机制仍不明确，目前最为公认的学说是三叉神经血管学说。

大麻是广为人知的天然镇痛物质，18世纪人们就已经将大麻作为治疗偏头痛的药物[3]。现代研究表明内源性大麻素（Endocannabinoids，eCBs）系统具有显著的镇痛抗炎作用，可以介导多种疾病的病理过程[4]。在20世纪末，人们找到了第一种“类大麻素样物质”N花生四烯酸乙醇胺（Anandamide，AEA），具有与△9四氢大麻酚（△9tetrahydrocannabinol，THC）相似的生物学效应，此后人们又发现了2花生四烯酸甘油（2arachidonic acid，2AG），从此人们对eCBs系统有了新的认识。

针灸作为传统中医疗法正逐渐被国内外所接受，在疼痛疾病方面具有优势[5]。有临床研究表明针刺治疗可以提高偏头痛发作天数减半率[6]。同时，美国神经协会认可了针灸在偏头痛治疗中的作用[7]。WHO也已经将“偏头痛”列入针灸治疗疾病的推荐疾病谱[8]。现代研究当中，多数学者关注针刺对内源性大麻素受体（Cannabinoid Receptor，CBR）的调节，对eCBs及其分解酶的关注不多。因此本文试图探讨针刺在对eCBs的释放和分解的干预在镇痛机制当中的作用，从而发现针刺治疗偏头痛的新机制。

1材料与方法

11材料

111动物成年雄性SD大鼠24只，体重200～220 g，由军科院提供。适应性喂养1周，单笼喂养，12：12 h明暗交替模拟昼夜。大鼠随机分为4组，即：对照组（C，只进行手术，不进行炎症汤注射）、模型组（M，炎症汤注射造模不给予电针）、单穴组（EA，造模并给予电针风池）和假穴组（NA，造模并给予电针假穴），每组6只。

12方法手术操作：用10%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，大鼠备皮后置于脑立体定位仪上，并固定住头部。消毒后大鼠头顶部沿正中线，逐层剪开组织彻底暴露颅骨。以大鼠颅骨前囟为原点，向左向前各1 mm处打穿颅骨。将套管放入钻孔中，用螺丝和牙科水泥进行固定。最后向套管内注射肝素钠封管。在大鼠下肢肌肉注射1 mL庆大霉素，待大鼠清醒后放回笼舍，手术后大鼠正常饲养恢复1周。

清醒状态下反复注射炎症汤：大鼠术后恢复后，将大鼠固定于特制的大鼠固定装置上，用微量注射泵以2 μL/min泵入20 μL炎症汤后封管。在实验第1、3、5、7、9 d注射炎症汤，对照组大鼠等速等量注射人工脑脊液。

配制炎症汤：组胺、5羟色胺和缓激肽，均为2 mM，和前列腺素E2（PGE2），分别为02 mmol，溶于pH50的10 mmol HEPES缓冲液中。

121电针治疗电针穴位选取参照《实验针灸学》[9]，单穴组取大鼠双侧“风池”穴（GB20），双穴组取大鼠双侧“阳陵泉”穴（GB34）。假穴取风池穴旁开1 mm。在实验第1、3、5、7、9 d进行电针治疗。电针（直径016 mm）进针约2～3 mm，连接华佗牌电针仪，电针参数：疏密波2 Hz，1～2 mA，强度以大鼠耳郭轻度抖动或局部肌肉收缩为度，电针治疗10 min。

122取材与ELISA检测取材在实验第9天进行，实验结束后用10%水合氯醛03 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠并以仰卧位固定。暴露大鼠双侧颈静脉，抽取1～2 mL大鼠颈静脉血并加入50 μL抑肽酶。离心机4 ℃、3 000 r/min离心15 min后取上清备用。利用ELISA法检测大鼠血清AEA、2AG、MAGL、FAAH含量，ELISA检测严格遵照试剂盒说明书进行。

13统计学方法采用SPSS 100统计软件进行数据分析，所得实验数据以均值±标准差（±s）表示，用单因素方差分析法对实验数据进行统计分析，以P<005为差异有统计学意义。

2结果

实验结果显示，大鼠血清中AEA的含量M组（862±092）显著低于C组（1335±143），且差异有统计学意义（P<0001），EA（1173±058）组高于NA（1010±090）组，差异有统计学意义（P<001），EA（1173±058）组高于M（862±092）组，差异有统计学意义（P<0001），NA组和M组比较差异无统计学意义。

实验结果显示，大鼠血清中MAGL的含量M组（1 02658±1491）ng/mL显著高于C组（82372±6122）ng/mL，差异有统计学意义（P<001），EA（71115±10907）ng/mL组低于NA（98586±698）ng/mL组，差异有统计学意义（P<005），EA（71115±10907）ng/mL组低于M（1 02658±1491）ng/mL组，差异有统计学意义（P<0001），NA组和M组比较，差异无统计学意义（P>005）。

此外，实验各组大鼠血清中2AG和FAAH含量差异均无统计学意義（P>005）。

3讨论

偏头痛是一种常见的神经内科疾病，迁延难愈且具有致残性和遗传倾向。本病至今发病机制并不明确，目前关于偏头痛的发病机制有神经学说、遗传学说及离子学说等多种学说，其中三叉神经血管学说是目前较为公认的学说。偏正头痛中医理论中均属于头风病，偏头痛是头风病的一种，其病属少阳经，本实验选穴风池是足少阳胆经要学，可祛风散寒，治疗头痛、眩晕等头部诸疾。

目前常用的大鼠炎症汤偏头痛模型主要有完全弗氏佐剂和配方炎症汤2类。本实验模型采用硬脑膜上反复配方注射炎症汤模型来模拟大鼠偏头痛发作。有文献报道称，反复向大鼠硬脑膜注射炎症汤可以诱发大鼠的偏头痛发作[10]。在硬脑膜上注射炎症汤后15 min可明显观察到硬脑膜血管扩张[11]。同时，注射炎症汤可以引发大鼠的中枢敏化和外周敏化，降低大鼠痛域。以上均说明硬脑膜上注射炎症汤是一种可靠的偏头痛动物造模方法。

在eCBs以及“类内源性大麻素样物质”中，AEA和2AG是目前研究最为深入的2种eCBs。AEA和2AG是2种“即时分泌”的逆行神经递质[12]，AEA和2AG在突触后膜分泌，作用于突触前膜的CBR，产生效应后立即被重新摄入到神经细胞内被eCBs分解酶分解。eCBs分解酶主要有2种，分别为脂肪酰胺水解酶（Fatty Acid Amide Hydrolase，FAAH）和单酰基甘油酯酶（Monoacylglycerol Lipase，MAGL），这2种分解酶分别对应分解AEA和2AG。随着研究的进展，人们试图通过开发分解酶抑制来降低eCBs的分解，从而研发新的镇痛药物。目前有学者针对eCBs分解酶开发新的抗偏头痛药物，发现当给MAGL基因敲除小鼠注射硝酸甘油时会引发小鼠的偏头痛样疼痛[13]。

本实验发现电针治疗可以有效干预偏头痛大鼠体内eCBs及其分解酶的含量。实验数据表明，大鼠血清中AEA含量M组比C组明显降低，MAGL含量M组比C组明显升高，说明偏头痛造模成功，同时说明偏头痛发作期间可以观察到大鼠eCBS系统有相应的变化。有研究表明，AEA可抑制偏头痛大鼠的痛觉过敏[14]。另外，MAGL基因敲除偏头痛小鼠出现了痛域下降[13]，這揭示当偏头痛发作时有eCBs及其分解酶的变化。本实验中大鼠血清中AEA含量EA组比M组明显升高，MAGL含量EA组比M组明显降低，可以说明针刺可以干预偏头痛大鼠源性大麻素分解酶，从而预防偏头痛发作。此外，大鼠血清中AEA含量NA组比EA组有降低，且MAGL升高，可以说明经穴和非经假穴在预防偏头痛发作方面具有疗效差异。另外，各组大鼠比较，FAAH和2AG 2个指标并差异无统计学意义，说明电针预防偏头痛发作并非依靠该2者起作用。出现该结果可能是电针增加AEA的分泌反射性的引起FAAH的升高，同时，电针激活了分解酶MAGL，所以2AG的含量有所下降。

本实验在技术选择上只选用了ELISA一种技术进行验证，同时也未观察大鼠具体脑核团的eCBs及其分解酶的含量，以上是该实验存在的不足之处，我们将在未来的实验中进一步深入探讨。

参考文献

[1]Burstein R，Noseda R，Borsook D.Migraine：multiple processes，complex pathophysiology[J].J Neurosci，2015，35（17）：66196629.

[2]Steiner TJ，Stovner LJ，Vos T.GBD 2015：migraine is the third cause of disability in under 50s[J].J Headache Pain，2016，17（1）：104.

[3]Baron EP.Comprehensive Review of Medicinal Marijuana，Cannabinoids，and Therapeutic Implications in Medicine and Headache：What a Long Strange Trip It′s Been [J].Headache，2015，55（6）：885916.

[4]Ryz NR，Remillard DJ，Russo EB.Cannabis Roots：A Traditional Therapy with Future Potential for Treating Inflammation and Pain[J].Cannabis Cannabinoid Res，2017，2（1）：210216.

[5]Li Z，Liu M，Lan L，et al.Altered periaqueductal gray resting state functional connectivity in migraine and the modulation effect of treatment[J].Sci Rep，2016，6：20298.

[6]Wang LP，Zhang XZ，Guo J，et al.Efficacy of acupuncture for migraine prophylaxis：a singleblinded，doubledummy，randomized controlled trial[J].Pain，2011，152（8）：18641871.

[7]Campbell JK，Penzien DB.EvidencedBased Guidelines For Migraine Headache：Behavioral and Physical Treatments[J].US Headache Consortium 1：129，2000，1：129.

[8]von Peter S，Ting W，Scrivani S，et al.Survey on the use of complementary and alternative medicine among patients with headache syndromes[J].Cephalalgia，2002，22（5）：395400.

[9]郭义，方剑乔.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2012：51212.

[10]Nelly Boyera B，Radhouane Dallela B C，Alain Artolaa B，et al.General trigeminospinal central sensitization and impaired descending pain inhibitory controls contribute to migraine progression[J].Pain，2014（7）：11961205.

[11]Lundblad C，Haanes KA，Grande G，et al.Experimental inflammation following dural application of complete Freund′s adjuvant or inflammatory soup does not alter brain and trigeminal microvascular passage[J].J Headache Pain，2015，16（1）：19.

[12]Chiurchiù V，dSM Van，Centonze D，et al.The endocannabinoid system and its therapeutic exploitation in multiple sclerosis：Clues for other neuroinflammatory diseases[J].Prog Neurobiol，2017，160：82100.

[13]Nozaki C，Markert A，Zimmer A.Inhibition of FAAH reduces nitroglycerininduced migrainelike pain and trigeminal neuronal hyperactivity in mice[J].Eur Neuropsychopharmacol，2015，25（8）：13881396.

[14]Greco R，Mangione A S，Sandrini G，et al.Effects of anandamide in migraine：data from an animal model[J].J Headache Pain，2011，12（2）：177183.

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