酶联免疫法测定大豆中赭曲霉毒素A
摘要：赭曲霉毒素A易溶于水和小苏打溶液，并且于极性有机溶剂中化学性质稳定不易发生反应。值得注意的是，赭曲霉毒素A具有较强的耐热性，烘烤只能使其毒性减少1/5，而水煮或者水蒸也不能破坏其毒性。有研究者对赭曲霉毒素A的耐热性做了研究，以半数存活量及50%有效性发现赭曲霉毒素A对热因素比较稳定，100～200℃间没有发现完全分解。检测赭曲霉毒素A常用的方法有很多，现介绍的酶联免疫法（ ELISA）则具有检测速度快、灵敏度高、准确性强、可以方便准确的定量、操作相对简便等优点，得到了快速发展和广泛的应用。
关键词：酶联免疫法；赭曲霉毒素A；大豆；真菌毒素
中图分类号：S565.1
文献标识码：B
文章编号：2095-9737（2018）08-0026-01
赭曲霉毒素是糧食真菌毒素污染的主要品种之一，赭曲霉毒素由赭曲霉和青霉菌污染大豆、玉米等饲料原材料及其他农副产品后所产生的一种具有强烈毒性的有害代谢物质。赭曲霉毒素产生速度快，存在范围广，许多菌种都可以产生赭曲霉毒素A，常用的实验室检测赭曲霉毒素A的方法很多，包括薄层色谱层析法（ TLC）、高效液相色谱法（HPLC），现主要介绍的是酶联免疫吸附法（ELISA）。
1 仪器试剂
试剂：氯化钠；氯化钾；磷酸二氢钾；十二水磷酸氢二钠；吐温20；柠檬酸钠；柠檬酸；四甲基联苯胺；过氧化氢（30%）；浓硫酸（98%）；赭曲霉毒素A标准物质；抗抗体；包被有抗抗体的48孔微孔板；赭曲霉毒素A单克隆抗体；赭曲霉毒素A酶标抗原；仪器：美国biorad680型酶标仪；实验粉碎机；微量移液器；多空能旋转混合器；涡旋混合器；电子天平（0.01 g）；20目标准筛。
以上药品未特殊注明的均为分析纯，水为一级水。
2 实验原理
酶联免疫分析法（ ELISA）结合了抗原抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化显色反应。用提取液即甲醇与水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸馏水）将粉碎后的大豆样品中赭曲霉毒素A提取出来，经过一系列过滤稀释后用酶标仪外标法测定赭曲霉毒素A的含量。
3 溶液配制
提取液：甲醇与水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸馏水）；稀释液：甲醇与水的混合溶液（5%甲醇+95%蒸馏水）；洗涤液：氢氧化钠40.0 g+氯化钾1.0 g+磷酸二氢钾1.o g+十二水磷酸氢二钠14.5 g；吐温2.5 mL加蒸馏水彻底溶解并定容至500 mL，使用时稀释10倍；赭曲霉毒素A稀释缓冲液：氯化钠8.0 g+氯化钾0.2 g+磷酸二氢钾0.2 g+十二水磷酸氢二钠2.9 g用蒸馏水溶解并定容至1000 mL备用；柠檬酸缓冲溶液：柠檬酸钠10.15 g+柠檬酸13. 76 g用蒸馏水溶解并定容至1000 mL备用；底物溶液甲：称取0.4g四甲基联苯胺用柠檬酸缓冲溶液溶解并定容至1000 mL备用；底物溶液乙：用移液器准确移取1.5 mL过氧化氢（30%）用柠檬酸缓冲溶液定容至1000 mL备用；反应终止液：移取浓硫酸（98%）22.2 mL缓慢加入到177.8 mL蒸馏水中。
4 样品处理
将大豆样品用四分法分取500 g，全部粉碎并使其全部透过20目筛，混合后用电子天平准确称取5.OO g待测样品于50 mL离心管中，随后加入25 mL提取液，拧紧盖子后置于多功能旋转混合器中充分混合10 min，用高速定性滤纸过滤后，用微量移液器准确移取滤液200 μL于1.5 mL离心管中，再加入200 μL配置好的赭曲霉毒素A稀释缓冲液，在涡旋混合器上涡旋混匀30 s，作为待测溶液备用。
5 标准曲线绘制及样品检测
5.1 样品检测
将微孔条插入酶标板的相应位置，分别加入50 μL待测溶液于微孔中，记录加样位置。再各加入50 μL赭曲霉毒素A酶标抗原，随后再加入50 μL赭曲霉毒素A抗体溶液，在酶标板上加好板盖，使反应在常温下进行40 min；之后将板孔中液体全部弃去后，用洗涤液洗板4次，保证洗涤彻底后用吸水纸吸干残余液体。之后再在孔中分别加入150 μL显色底物溶液，反应15 min后加入终止液50 μL终止显色反应，最后置于酶标仪中以630 nm为参比，测定450 nm处吸光度。
5.2 标准曲线绘制
用赭曲霉毒素A标准品和甲醇配制浓度为100 μg/mL的标准储备液，再用稀释液（5%甲醇溶液）配制浓度为O ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.O ng/mL、2.O ng/mL、5.0 ng/mL的赭曲霉毒素A标准序列溶液，经过与样品提取溶液相同的处理后，用酶标仪测定其450 nm处的吸光度，以赭曲霉毒素A浓度的对数为横坐标，吸光度的百分值为纵坐标绘制外标标准工作曲线。用样品溶液测得的吸光度值与标准曲线比较定量。
6 结论
该方法相对于高效液相色谱法有特异性强、操作简便等优点，较薄层色谱法具有定量准确等优势，在检测量大，对定量的灵敏度以及准确度有较高要求的实验中，有较强的实用性。
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