低磷胁迫大豆RTqPCR内参基因的筛选及谷胱丙肽合成代谢酶的表达
摘要： 谷胱丙肽在作物耐低磷中起重要作用，而选择稳定的内参基因是保证实时荧光定量PCR（RTqPCR）结果准确的前提。该研究检测了低磷和正常条件下两个不同磷效率的大豆品种根叶中15个内参基因的表达，GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt对比和RefFinder分析表明PSC、TUB和18sRNA的稳定性最好；同时以这3个基因为内参，检测了不同磷胁迫时期谷胱丙肽合成代谢中两个关键基因谷氨酸半胱氨酸合成酶（ γECS）和谷胱丙肽合成酶（hGSHS）的表达水平。结果表明：低磷胁迫下，磷低效品种桂香1号（GX1）根叶中γECS和hGSHS的相对表达量（Fold change， FC）都随着胁迫时间延长而减少；磷高效品种桂夏2号（GX2）根叶γECS以及根中的hGSHS的相对表达量都随着胁迫时间延长而增加，而叶片中hGSHS的相对表达量随胁迫时间增加而降低。谷胱丙肽合成酶基因表达差异可能是品种磷效率差异的原因。该研究结果为大豆低磷抗性分子机理研究提供了理论依据。
关键词： 大豆， 内参基因， 实时荧光定量PCR， 谷胱丙肽合成代谢， 低磷
中图分类号： Q945文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）08100811
Abstract： Selection of stable reference gene（s） is the prerequisite for RTqPCR analysis. Homoglutathion plays an important roles in utilization of phosphate in plants. In this study， the expression of fifteen candidate reference genes were determined in two soybean varieties differing in phosphorus efficiency under normal and stress of low phosphorus availability. Fifteen candidate reference genes were validated by GeNorm， NormFinder， BestKeeper and ΔCt comparision and RefFinder analysis， and out of those， the three most stable genes， PSC， TUB and 18sRNA， were used to normalize the expression of two genes， γglutamylcysteine synthetase （γECS） and homoglutathione synthetase（hGSHS）， involved in homoglutathion anabolism. In the low P efficient soybean variety GX1， the expression fold changes （FC， as compared to normal） of γECS and hGSHS in roots and leaves all decreased with the rise of stress duration； while in the high P efficient variety GX2， the FCs of γECS in roots and leaves， as well as hGSHS in roots increased with the increase of stress duration； except that hGSHS in leaves decreased. The results suggest that the difference of gene expression might account to the phosphorus utilization efficiency.
Key words： soybean， reference gene， homoglutathione anabolism， RTqPCR， phosphorus deficiency
实时荧光定量PCR（realtime quantitativereverse transcription PCR，RTqPCR）因具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点，已广泛应用于基因的表达分析（Valasek & Repa， 2005），但在RTqPCR过程中易受到RNA提取、逆转录过程和PCR扩增效率等因素影响，导致目标基因真实表达值与实验值间存在差异。为获得真实可靠的实验结果，需引入稳定表达的内参基因对目的基因的表达量进行均一化处理，但目前未发现任何一个内参基因能够在所有实验环境下稳定表达，只有在特定的实验处理下，在一定的组织和细胞中，存在某些相对恒定表达的内参基因（Suzuki et al，2000）。如在甜樱桃的营养器官中，最适合的内参基因为CYP2，而在生殖器官中，最适合的内参为SAND2（张芳明，2013）；吝爱月（2012）对玉米的研究显示，CYP是低温和铝毒胁迫下稳定性最强的内参基因；EFlα是高温和盐胁迫下最合适的内参基因；TUB是干旱胁迫下最合适的内参基因等；还有针对茶树（Hu et al，2009）、菠萝蜜（汪永保等，2014）、芝麻（刘莉铭等，2012）等植物内参基因的筛选，发现其结果也不尽相同。由于内参基因的稳定性存在差异，研究者需根据自己的实验要求来筛选相对稳定的内参基因。
大豆（Glycine max， soybean）是我国主要的油料作物，是全人类最主要植物性蛋白质的来源之一，在医学、工业生产、畜牧养殖业方面也有很大价值。南方土壤中的磷易与铝形成沉淀，大豆不能有效吸收磷元素，缺磷成为了南方地区影响大豆产量主要问题之一。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种抗氧化剂，通过AsadaHalliwell途径清除活性氧、保护植物体内生物大分子的巯基（SH） 在生物体内能保护DNA、蛋白质和其他生物分子抵抗氧化损伤，其在生物体抵抗各种胁迫（冷害、干旱、重金属、真菌等）的过程中起重要作用（Lxppartient et a1，1999）。大豆中谷胱丙肽（homoglutathione，hGSH）几乎具有GSH的全部功能（Hopkins，1929）。hGSH的生物合成分两步完成，首先γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γglutamylcysteine synthetase， γECS）催化L谷氨酸和L半胱氨酸下合成γ谷氨酸半胱氨酸（γglutamylcysteine， γEC）；然后在谷胱丙肽合成酶（homoglutathione synthetase， GSHS）的催化下，丙氨酸被添加在γ谷氨酸半胱氨酸C末端生成hGSH。γECS和hGSHS被认为是GSH生物合成过程中的关键酶，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度有关。γECS和hGSHS是由γECS和hGSHS独立进化的，γECS可能起源于蓝细菌，hGSHS 出现后，真核细胞和大多细菌才分別独立的进化获得hGSHS（Copley & Dhillon，2002）。拟南芥GSHS序列与其它真核生物的cDNAs具有很高的序列同源性，而γECS序列却有很大差异（May，1994）。γECS和hGSHS的表达量高低与植物抗逆性有密切相关。