甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖转化酶表达分析
摘要：甘蔗脱毒健康种苗能够有效提高植株生物量和糖分，而蔗糖转化酶则是甘蔗生长和蔗糖积累的关键酶。拟分析3种甘蔗蔗糖转化酶基因，即可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase，简称SAI）、可溶性中性转化酶（neutral invertase，简称NI）和细胞壁酸性转化酶（cell wall-bound invertase，簡称CWI）基因在脱毒种苗、常规种苗全生育期的表达量差异。结果表明，细胞壁酸性转化酶主要在脱毒健康种苗拔节期未成熟叶片、茎及成熟期叶片、未成熟茎节中上调表达，尤其在成熟期未成熟茎节中大幅上调表达，促进茎节的快速生长和蔗糖的卸载及积累；液泡可溶性酸性转化酶SAI、可溶性中性转化酶主要在成熟期叶片和未成熟茎节中上调表达，有利于促进成熟期脱毒健康种苗茎秆中糖分积累及对单糖的快速利用。进一步研究表明，脱毒处理可以提高甘蔗生长后期蔗糖转化酶的表达量，有利于生物量和蔗糖含量的增加，可能是脱毒健康种苗增糖增产的分子调节机制之一。
关键词：甘蔗；脱毒健康种苗；蔗糖转化酶；表达量
中图分类号： Q9465；S566101文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0035-04[
收稿日期：2016-06-08
基金项目：国家“863”计划（编号：2013AA102604-1）；海南省自然科学基金（编号：20163124）；中央级公益科研院所基本业务费（编号：ITBB140503）；现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-20-2-5）。
作者简介：王俊刚（1983—），男，湖北孝感人，博士研究生，助理研究员，研究方向为甘蔗生物技术。Tel：（0898）66987509；E-mail：wangjungang@itbborgcn。
通信作者：张树珍，博士，研究员，研究方向为甘蔗生物技术。Tel：（0898）66987509；E-mail：zhangsz2007@163com。
甘蔗是禾本科甘蔗属多年生草本C4植物，是将光能转化为化学能效率最高的作物之一，是世界上重要的糖料作物和能源作物，约生产全球70%的食糖和42%的乙醇[1]。蔗糖是甘蔗生产的主要物质，其合成和积累过程是一个系统的调控网络，涉及到各种蔗糖代谢相关酶、转运蛋白及信号分子等的调节作用[2-3]，而蔗糖转化酶能够催化蔗糖的水解，影响茎秆蔗糖含量[4-5]。高等植物中含有多个编码蔗糖转化酶的基因，蔗糖转化酶既存在于光合组织中，也存在于非光合组织中，主要累积于细胞质、液泡和细胞间隙。高等植物中转化酶依据不同的溶解性、亚细胞定位和最适pH值，可以分为3种类型：（1）可溶性中性转化酶（neutral invertase，简称NI），为非糖基化形式，存在于细胞质中，最适pH值为中性或弱碱性（pH值70～80），在植物组织中降解蔗糖满足代谢中对己糖的需求；（2）可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase，简称SAI），主要存在于液泡中，为糖基化形式，其活性最适pH值为酸性（45～50），参与调节光合同化产物在淀粉和蔗糖间的分配及控制蔗糖己糖比率[6-7]；（3）细胞壁酸性转化酶（cell wall-bound invertase，简称CWI），最适pH值为酸性（45～55），但有较高的pI值（9～10）。细胞壁转化酶则主要负责调节蔗糖从叶片（源）中输出的速率，是蔗糖源源不断地向库细胞卸载的重要动力[8-10]，促进植物细胞从源代谢向库代谢的转变，有助于库器官的生长和代谢产物的长距离运输[11-12]。
甘蔗多年宿根种植引起甘蔗品种退化，利用腋芽茎尖脱毒处理能够恢复母本性状，使甘蔗产量增加20%～40%，含糖量增加05～10百分点[13-15]，但是有关从分子生物学水平研究脱毒处理对蔗糖转化酶表达量的影响还未见报道。本研究以已报道的3个甘蔗蔗糖转化酶为研究对象，从甘蔗生长的苗期、分蘖期、拔节期和成熟期对其表达量进行比较分析，探讨脱毒处理与蔗糖转化酶表达量之间的关系，以便从分子生物学层面上分析脱毒处理对转化酶表达量的影响，揭示脱毒健康种苗可能的增产增糖机制。
1材料与方法
11试验材料
供试材料为新台糖22号品种腋芽脱毒健康种苗二代种茎苗和未脱毒新台糖22种茎，来源于中国热带农业科学院热带生物技术研究所甘蔗试验地。
12试验地点
试验地点设在海南省临高县皇桐镇国家甘蔗产业技术体系试验站，土壤为红壤，肥力中等。
13田间试验设计和管理
参照文献[15-16]的有关方法进行处理。
14总RNA提取、定量与完整性检测
取从10个完整植株剥离的冻存样品进行研磨，用TRIzol法提取RNA，TRIzol RNA提取试剂购自Aidlab （艾德莱）公司。用核酸分析仪（Eppendorf Biophotometer Plus）测定260、280 nm处的吸光度，以D260 nmD280 nm值估计总RNA的纯度，以D260 nm进行总RNA定量。用10%普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
15第一链cDNA的合成
取3 μg甘蔗总RNA与1μL反转录引物（10 pmolL）（Oligo-dT接头引物）混合，65 ℃加热5 min后，立即放置于冰上，然后加入5×buffer、25 mmolL dNTP混合液、40 UμL Ribonuclease Inhibitor、5 UμL M-MLV反转录酶，反应体系为 25 μL。反应过程如下：42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，5 min后瞬时离心，最后于-80 ℃保存备用。
16引物设计
根据公布的甘蔗蔗糖转化酶基因CWI（GenBank登录号：BU925833）、NI（GenBank登录号：KC145797）、SAI（GenBank登录号：AY302083） 序列，利用Primer5设计引物，内参GADPH基因引物参考文献[17]，详见表1。
17实时PCR（Real-Time PCR）扩增及数据分析
建立20 μL荧光定量PCR反应体系，选用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）试剂盒，按照说明书操作要求配制，反应在Mx3005PTM（Roche）上完成，每个处理设置3次重复，扩增效率见表1。以甘蔗GADPH基因为内参基因，所有结果以2-ΔΔCT法计算相对定量值[18]。
2结果与分析
21RNA纯度鉴定
不同组织以及不同生长时期的总RNA琼脂糖凝胶电泳结果表明，28S、18S条带清晰可见，无明显降解；D260nmD280nm值皆在18～22之间，可用于下一步试验。
22苗期甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖转化酶基因表达分析
Real-Time PCR结果显示：CWI、NI和SAI在苗期甘蔗叶片中均有表达；在未成熟叶片中CWI表达量比对照约低80%，NI表达量比对照高2倍左右，SAI表达量比对照低97%以上；而在成熟叶片中，CWI表达量差异不明显，NI表达量比对照高2倍左右，SAI表达量比对照高15倍左右（图1）。
23分蘖期甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖转化酶表达分析
约在甘蔗第1株分蘖苗长出7 d后，对主茎甘蔗进行采样，对甘蔗分蘖中期蔗糖转化酶基因表达特征进行分析。结果表明：与常规种苗相比，在分蘖期脱毒健康种苗中，CWI在成熟叶片中上调表达，NI、SAI在未成熟叶片中上调表达（图2）。
24拔节期甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖转化酶表达分析
与常规种苗相比，在拔节期甘蔗脱毒健康种苗中，CWI在未成熟叶片和茎节中上调表达，在未成熟叶片中CWI表达量上调约25倍，CWI的表达量在1～3茎节中上调约26倍，在4～5茎节中的表达量上调约21倍，在7～8茎节中的表达量上调约16倍，在10～11茎节中的表达量上调约5倍，在 13～14 茎节中的表达量上调约2倍，在16～17茎节中的表达量上调约1倍；NI在未成熟叶片中的表达量上调约45倍；SAI在7～8茎节中的表达量上调约3倍（图3）。
25成熟期甘蔗脱毒健康种苗蔗糖转化酶表达分析
与常规种苗相比，在成熟期甘蔗脱毒健康种苗中，CWI、NI和SAI在叶片和未成熟茎节中得到大幅度上调表达，从而促进脱毒种苗生物量、糖分的增加。CWI在未成熟叶片中表达量上调近50倍，在成熟叶片中表达量上调近90倍，在1～3茎节中表达量上调近65倍，在4～5茎节中表达量上调近25倍；NI在未成熟叶片中表达量上调约35倍，在成熟叶片中表达量上调近52倍，在1～3茎节中表达量上调约120倍，在4～5茎节中表达量上调近40倍；SAI在未成熟叶片中表达量上调约55倍，在成熟叶片中表达量上调近25倍，在 1～3茎节中表达量上调近80倍，在4～5茎节中表达量上调近30倍（图4）。
3讨论
甘蔗脱毒健康种苗能够恢复甘蔗母本的性状，显著提高甘蔗产量，并有效增加蔗糖含量，从而延长优良甘蔗品种使用年限，而关于脱毒健康种苗增产增糖的分子机制仍不清楚。甘蔗蔗糖转化酶是影响甘蔗生长和糖分积累的关键酶之一[19]。在库器官中，转化酶活性是影响蔗糖积累的先决条件[20]。甘蔗中蔗糖转化酶基因为一种组成型表达基因，随着甘蔗组织成熟表达量逐渐降低[21-22]。相关研究表明，不同蔗糖转化酶基因在甘蔗不同组织中的表达模式不同，对甘蔗生长和糖分积累的调节功能也不同[23-24]。
细胞壁转化酶在碳水化合物分配及库器官发育中起重要调节作用，是韧皮部质外体卸载的关键基因[25]。植物库器官中细胞壁酸性转化酶的活性增強有利于蔗糖卸载及积累，同时有利于种子的形成[26-27]。研究表明，成熟期甘蔗茎秆中，蔗糖的积累量与细胞壁转化酶活性呈正相关，表明CWI参与调节蔗糖积累[3]。叶片中蔗糖转化酶可为甘蔗生长提供碳源，促进甘蔗快速生长。研究表明，在拔节期茎秆快速发育时期，脱毒健康种苗茎中CWI基因上调表达，有利于蔗糖的卸载及茎节的快速生长；在成熟期的脱毒健康种苗叶片和未成熟茎节中，CWI基因大幅上调表达，进一步促进蔗糖的卸载、积累以及提高甘蔗的最终生物量，表明CWI是促进甘蔗健康种苗增产增糖的关键调节基因。
植物中SAI基因参与糖分积累以及渗透压的调节，尤其在己糖含量高的组织中高表达[28-29]。牛俊奇等研究表明，甘蔗SoSAI1基因在拔节期至生理成熟前期，在未成熟叶和成熟叶中表达量高于老叶，茎秆中的表达模式为幼茎>成熟茎>老茎[30]。在脱毒健康种苗中，在拔节期蔗糖快速积累的茎节、成熟期叶片、未成熟茎节中SAI基因上调表达，且在成熟期未成熟茎节中大幅上调表达，表明SAI促进这些组织中己糖的供给和利用，从而加速植株的碳利用[31-32]，提高生物量[33]。
植物中中性转化酶功能仍不明确，可能参与细胞中葡萄糖稳态及糖信号形成[34]。甘蔗茎秆中中性转化酶活性与蔗糖含量呈负相关[35]。研究表明，叶片中SoNIN1基因比茎秆中的表达量高，分析认为，茎秆中中性转化酶低水平表达可能有利于蔗糖积累[30]。本研究对中性转化酶基因表达分析表明，NI基因主要在成熟期甘蔗脱毒健康种苗成熟叶片和未成熟茎节中大幅上调表达，表明NI可能在甘蔗成熟期促进叶片和未成熟茎节中蔗糖水解，从而促进细胞对葡萄糖的利用，加快植株生长。已有研究表明，在转甘蔗反义SNI基因植株中，中性酶活性受到抑制，导致蔗茎中己糖含量减少，蔗糖含量增加[35]。进一步研究表明，经过脱毒处理的甘蔗种苗，能够显著改善成熟期叶片、未成熟茎节中中性转化酶基因的表达，可能有利于促进植株生物量的增加。
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