脂质体荧光探针检测磷脂酶C的活性
摘要建立了一种以荧光标记脂质体为探针检测磷脂酶 C （PLC） 活性的新方法。此荧光探针是由二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和丽丝胺罗丹明B标记的荧光磷脂（Liss Rhod PE）通过自组装形成有序的荧光标记脂质体，探针脂质体中Liss Rhod PE由于相互之间距离靠近产生自猝灭效应，因而作为探针的脂质体并不表现出荧光性质。当在此探针溶液中加入目标物PLC，PLC可以水解切割标记在磷脂酰基二位上的荧光团罗丹明，使其从脂质体释放到溶液中，导致自猝灭效应的减弱，溶液荧光信号增强，以此实现对PLC活性的检测。使用此探针检测PLC活性，荧光强度的增加值与PLC浓度在5～300 U/L范围内呈良好的线性关系，检出限为2 U/L（S/N=3）。此外，此探针还可用于PLC抑制剂的筛选。
[KH*3/4D][HTH]关键词荧光； 脂质体； 探针； 磷脂酶C； 抑制剂
1引 言
磷脂酶降解磷脂产生自由的脂肪酸、血溶性脂、胆碱和磷脂酸[1]。磷脂酶降解磷脂的过程包含了一系列生物作用，如新陈代谢、消化、炎症反应、膜运输、细胞间信号传导[1，2]。磷脂酶是一个大家族，磷脂酶C（PLC）是其中的重要一员，它可以催化水解磷脂分子中的磷酸酯键，水解产物为二酰基甘油和磷酸胆碱[3]。这种水解过程与一些癌细胞中异常的胆碱代谢有关[4]。因而快速、灵敏的检测体液中的PLC活性极为重要。
目前，常见的检测PLC酶活性的方法有核磁共振法[5]、比浊法[6]、放射性测定法[7]、色谱法[8]等，上述方法各具特色且大都具有较高的灵敏度，但通常需要昂贵的仪器且操作繁琐。因此，简单、灵敏的检测磷脂酶活性的方法越来越为人们所关注。近年来，荧光光谱法因其具有灵敏、快速和操作简单的优点而被广泛应用于酶活性检测和酶抑制剂的筛选研究[9]。除了常规的分析方法，基于功能化的纳米粒子的荧光法也已被应用于磷脂酶活性检测。如Sun 等合成了具有荧光的功能化金纳米簇，利用荧光光谱法测定了酸性磷酸酶[10]、乙酰胆碱酯酶[11]和焦磷酸酶[12]的活性。Liu等[13]将罗丹明标记磷脂组装到石墨烯两侧，利用石墨烯猝灭罗丹明荧光制得了纳米探针。在磷脂酶D存在时，磷脂酶D切割磷脂释放罗丹明，体系荧光增强。据此实现了磷脂酶D活性的高灵敏检测。Chen等[14]使用磷脂分子和金纳米粒子制备了一种具备荧光性质的脂质体金纳米粒子复合物， PLC可以切割磷脂分子破坏脂质体复合物，减小氧自由基对探针荧光的抑制，通过检测荧光的增强实现了PLC活性的检测。作为磷脂酶的天然底物，利用荧光标记的磷脂分子形成的脂质体探针正越来越多的被用于磷脂酶的检测[15]以及药物载体[16]。相对于游离的脂质体，磷脂酶对形成脂质体的磷脂通常具有更高的催化活性。本研究采用荧光分子罗丹明标记的磷脂通过混合自组装制备了脂质体荧光探针，罗丹明因自猝灭效应并不表现出明显的荧光。利用PLC水解构成脂质体的磷脂释放荧光分子罗丹明，通过荧光增强实现了PLC活性的检测。
2实验部分
2.1仪器与试剂
F7000荧光仪（日本日立公司）；Zetasizer NanoZS90激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。
二棕榈酰磷脂酰胆碱（1，2Dipalmitoylsnglycero3phosphocholine，DPPC）和丽丝胺罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺（1，2Dimyristoylsnglycero3phosphoethanolamineN（lissamine rhodamine B sulfonyl） （ammonium salt），Liss Rhod PE）均购自Avanti Polar Lipids公司；磷脂酶C（PLC，来源于产气荚膜梭菌）、曲通X100和羟乙基哌嗪乙硫磺酸 （HEPES）（SigmaAldrich公司）；PLC酶抑制剂U73122（Selleck公司）； CaCl2（西安化学试剂厂）。所用试剂均为分析纯，缓冲溶液和储备溶液均使用超纯水（Millipore MilliQultrapureQ，>18.2 MΩ cm）配制。
2.2实验方法
2.2.1探针的制备将0.2 mg Liss Rhod PE （200 μL 1 mg/mL儲备液）、0.8 mg DPPC（32 μL 25 mg/mL储备液）的氯仿溶液混合，在超声条件下逐滴加入到3 mL水中，超声至溶液均匀， 避光放置过夜，即得到荧光脂质体探针， 4℃保存。
2.2.2荧光检测将50 μL PLC加入到100 μL 10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2，pH=7.4）缓冲液和50 μL探针的混合液中，室温下检测其荧光强度并记录数据。荧光检测条件：扫速240 nm/min，激发波长530 nm，激发和发射狭缝宽度5 nm，PMT=700 V，荧光测定使用1 mm×10 mm荧光比色皿。
2.2.3钙离子的影响在原有10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2， pH=7.4）缓冲溶液中加入5 mmol/L EDTA，并在此缓冲液中按上述步骤测定加入100 U/L PLC对探针液进行水解后的荧光强度。
2.2.4抑制剂实验将不同浓度的U73122与浓度为100 U/L PLC培养20 min后，将其混合液加入到探针液中进行荧光强度测定。
3结果与讨论
3.1实验原理图
使用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）和罗丹明B标记的荧光磷脂（Liss Rhod PE）制备荧光标记脂质体探针，用于PLC活性的检测。检测原理如图1所示，当DPPC和Liss Rhod PE通过自组装形成脂质体，荧光标记分子罗丹明之间的距离被拉近，出现荧光自猝灭现象。脂质体探针并不表现出荧光性质。当PLC存在时，PLC催化水解磷脂释放出荧光分子罗丹明，使得强荧光物质罗丹明B[17]荧光得以恢复。基于罗丹明B荧光的增强实现PLC活性的检测，这一探针也可用于PLC抑制剂的筛选。
3.2脂质体探针的制备和表征
荧光探针能够检测PLC活性主要基于脂质体内部Liss Rhod PE荧光的自猝灭及酶水解释放引起的荧光变化，因而DPPC和Liss Rhod PE的比例是制备脂质体时需要考察的因素。综合考虑背景荧光、酶水解后荧光强度及制备成本，对脂质体探针中Liss Rhod PE的比例进行了优化。结果表明，DPPC和Liss Rhod PE比例是8∶2时，猝灭效率最大的条件下Liss Rhod PE用量最少。利用丁达尔现象和动态光散射纳米激光粒度仪对脂质体探针进行了表征。首先利用丁达尔现象验证了探针溶液的胶体性质，结果如图2A所示。在激光照射下，脂质体溶液中出现了一道明显的光路，表明脂质体在溶液是以胶体形式分散的。为测定脂质体粒径分布，利用动态光散射对脂质体进行了测量。如图2B所示，脂质体探针的粒径主要分布在143 nm左右。上述结果表面脂质体探针已被成功制备，且粒径分布均匀。
3.3方法可行性研究
首先对检测的可行性进行了验证，结果如图3所示。在没有PLC时，脂质体探针只表现出微弱荧光（图3曲线a），表明脂质体探针中的荧光基团罗丹明B的荧光发生自淬灭。
曲线b是将100U/L PLC加入到探针溶液中孵育1 h后溶液的荧光光谱。可以观察到相对于探针本身的荧光，加入PLC后探针溶液的荧光增强了约10倍，表明探针对PLC产生了响应。这主要是由于加入PLC后，PLC水解甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键，将标记的罗丹明B从脂质体上水解下来，荧光基团罗丹明B离开脂质体进入溶液，导致自淬灭现象减弱，罗丹明B荧光得到恢复。为进一步证明加入PLC后探针溶液的荧光增强来自于脂质体探针水解下来的荧光分子罗丹明B，向探针溶液中加入表面活性剂曲通X100（25 mg/mL）， 结果如图3曲线c所示。罗丹明B的荧光强度显著增大，约为原来脂质体探针荧光强度的35倍，表明曲通X100破坏了脂质体结构，导致了脂质体探针分解，將罗丹明B完全释放，故罗丹明B荧光完全恢复[18]。为了证实35倍的荧光增强确实来自于罗丹明的完全释放，在探针和PLC反应60 min的溶液中加入曲通X100，发现溶液荧光强度继续增强至与单独探针溶液中加入曲通X100一致。这些结果表明PLC可以水解探针，但水解效率较低，因而无法完全释放罗丹明。上述结果同样表明，标记在磷脂上的罗丹明B荧光因为形成脂质体而产生自猝灭，PLC能够水解磷脂释放罗丹明B，导致探针的荧光增强。这一现象可用于以荧光脂质体作为探针检测PLC酶的活性。
PLC的活性依赖于Ca2+的激活作用，为证明荧光变化确实是PLC水解释放罗丹明，考察了Ca2+对荧光的影响，结果如图4所示。曲线a为将PLC加至脂质体探针中水解后所测得的荧光强度对时间的光谱图，0～3 min体系并不表现出荧光性质；随着PLC的加入，体系荧光开始逐渐增强；60 min后荧光强度增加趋于平缓，表明体系达到了平衡。曲线b为在体系中加EDTA后测得的荧光强度对时间的关系图，EDTA体系荧光基本没有恢复，这说明体系中的PLC没有起到水解作用。这主要是因为体系中的EDTA与Ca2+发生络合反应，使检测体系中不存在游离的Ca2+。没有Ca2+的激活作用，PLC就无法进行水解。由此证明体系荧光的增强确实来自于PLC对探针脂质体的水解作用。
3.4方法的选择性
磷脂酶家族中除了PLC之外，还包括磷脂酶A2（PLA2）和磷脂酶D（PLD），为了考察脂质体探针的选择性，研究了脂质体探针对PLA2和PLD的响应。如图5所示，曲线a为脂质体探针的荧光光谱，探针表现出微弱的荧光；如曲线b所示，当在脂质体探针中加入50 U/L PLC后，体系荧光强度增了约6倍。曲线c为在脂质体探针中加入50 U/L PLA2后的荧光光谱，加入PLA2后体系荧光强度增加，但相比PLC荧光增大的程度明显较小；曲线d为在脂质体中加入50 U/L的PLD后的荧光光谱，此时体系的荧光基本没有变化，与之前脂质体探针的荧光强度基本相等。上述结果表明，荧光脂质体探针对PLC具有良好的特异性，尽管PLA2和PLD也会催化水解磷脂[3]，但只有PLA2对PLC的检测产生一定的干扰。
3.6抑制剂的筛选
为了证明本方法可用于PLC抑制剂研究，选择了对PLC有强抑制作用的U73122进行实验[19]。图7A为在检测体系中含有不同浓度抑制剂的条件下，PLC对探针水解后的荧光光谱图。在PLC浓度为100 U/L条件下，U73122的浓度依次为0， 1， 5， 10， 15， 25， 50和100 μmol/L。随着体系中U73122浓度依次增大，体系的荧光恢复程度逐渐减弱，即PLC活性逐渐降低。图7B为加入PLC 1 h后的荧光强度与抑制剂浓度的关系图，可计算出 U73122 的 IC50（抑制 PLC活性至50% 时对应的抑制剂浓度）为17 μmol/L。表明本方法可用于PLC酶抑制剂的筛选。
4结 论
本研究制备了荧光标记的脂质体作为探针用于PLC活性检测。探针中荧光基团会由于距离接近发生荧光自淬灭现象，PLC的水解作用可以使荧光标记的脂质体发生降解，从而将荧光基团从探针中释放出来，荧光基团的荧光得以恢复。通过测定加入PLC前后荧光强度的变化对PLC的活性进行检测。本方法具有良好的灵敏度和特异性，探针制备容易，检测操作简单，可用于酶抑制剂的筛选。
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Fluorescence Assay for Phospholipase C Activity Using Liposome Probes
GU QiaoRong， AI JunJie， ZHANG QianYun， DONG YaNan， GAO Qiang*
（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi Normal University， Xi"an 710062， China）
AbstractA simple assay for detection of phospholipase C （PLC） activity was developed based on a fluorescence liposome probe using the Liss Rhod PEloaded phospholipid liposomes. The liposome probe was prepared by the coassembly of 1，2dipalmitoylsnglycero3phosphocholine （DPPC） and fluorescent lipid （Liss Rhod PE）. The probe showed very low background fluorescence due to fluorescence selfquenching effect of Liss Rhod PE. As the PLC enzyme selectively digested lipid， the Rhod fluorescence was recovered from its quenched state， leading to the sensitive detection of PLC. This assay provided a limit of detection （at a signaltonoise ratio of 3） of 2 U/L for PLC. In the presence of PLC inhibitor， the fluorescent response of the sensor for PLC decreased， indicating that the assay could also be used for screening PLC inhibitors.
Keywords Fluorescence； Liposome； Probe； Phospholipase C； Inhibitor
（Received 23 March 2017； accepted 18 July 2017）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21175089）.