再生水中的Cd对蔬菜根际土壤酶及微生物的影响
摘 要：通过盆栽实验，探讨再生水中的Cd对蔬菜土壤酶和微生物的影响。设置4种灌溉方式：清水、清水+Cd、再生水、再生水+Cd，分析了小白菜根际土壤的磷脂脂肪酸的含量和土壤脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性的变化。结果表明：1.小白菜收获期的土壤微生物PLFA的含量表现为再生水>再生水+Cd>清水>清水+Cd；2.小白菜生长中期蔗糖酶含量中，再生水灌溉与清水对照存在显著差异（P<0.05），表现为再生水灌溉>清水灌溉，且再生水+Cd处理下的蔗糖酶活性显著大于再生水灌溉（P<0.05）；3.碱性磷酸酶活性在小白菜生长中期和收获期差异不大，且在4种不同灌溉处理之间差异显著（P<0.05）。
关键词：再生水；Cd；小白菜；土壤酶；PLFA
中图分类号：XS3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.09.004
Abstract： This paper discussed the effect of Cd in reclaimed water on soil enzymes and microorganisms in vegetable rhizosphere. Setting four irrigation methods：water，water+Cd， reclaimed water，reclaimed water+Cd. Analyzed the contents of PLFA and the activities of soil urease， invertase and alkaline phosphatase in rhizosphere soil of Brassica chinensis. The results showed that the content of PLFA in soil during the harvest of Chinese cabbage was reclaimed water>reclaimed water+Cd> water>water+Cd.There was a significant difference in the content of sucrosease in the mid-growth of Chinese cabbage（P<0.05），manifested as reclaimed water irrigation> water irrigation，And the activity of sucrosease under the condition of reclaimed water + Cd was significantly higher than that of reclaimed water（P<0.05）.Alkaline phosphatase activity was not significantly different from that in Chinese cabbage， and there were significant differences among the four different irrigation treatments（P<0.05）.
Key words： reclaimed water； Cd； cabbage； soil enzyme； PLFA
再生水又叫做中水，是對各类生活污水和工业废水等进行二级或二级以上处理之后达到一定的水质标准，并在一定范围内可进行重复使用的非饮用水[1]。但相对于常规的灌溉用水，再生水的氮、磷、钾较丰富，并含有大量的微生物及一定的重金属残留，这不仅可能危害植物生长，还会对土壤酶活性产生影响。在农业用水严重紧缺的现状下，实现再生水农业安全利用，将开辟农业用水的新途径[2]。
Cd是生物毒性最强的重金属元素之一，其迁移性很强且极易被植物吸收并积累。新疆农业大学曾对乌鲁木齐地区部分农田土壤的重金属含量进行了调查分析发现：30%的土壤样品存在Cd超标，最高值达到20.6 mg·kg -1，是国家无公害生产标准（0.6 mg·kg -1）的34倍[3]。
土壤酶作为土壤中一切化学生物过程的主要参与者，是能量流动和生态系统物质循环等过程中表现最活跃的生物活性物质[4-6]。由于土壤酶敏感、稳定的特性，其活性能较敏感地对土壤中生化反应的程度和方向做出反映，是探讨重金属污染生态效应的有效指标之一[7-8]。
土壤微生物是维持土壤生物活性的重要组分，它参与土壤中的能量流动、营养循环和有机物转化，土壤微生物对干扰反应和养分较敏感，其多样性和群落结构可较早地反映出土壤环境质量的变化过程，越来越受到科学家们的重视[9]。目前，磷脂脂肪酸（ PLFA ） 分析被较多地应用于土壤微生物多样性研究[10]。PLFA检测方法是根据脂肪酸可作为生物标记物从而发展起来的分析技术，鉴定微生物的种属和分析微生物多样性是通过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸的组分来实现的。
文章采用盆栽实验种植小白菜，研究对象是土壤-小白菜-再生水-Cd-土壤酶-微生物之间的相互作用体系，对再生水灌溉小白菜的可行性及Cd处理土壤后较敏感的生物学指标进行探讨，为再生水浇灌蔬菜对土壤生态系统的综合评价提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 水样、土壤的采集
盆栽灌溉所用再生水为乌鲁木齐市虹桥污水处理厂的出水，其各项水质指标均符合 SL368—2006《再生水水质标准》和 GB5084—2005《农田灌溉水质标准》；以新疆农业大学实验室市政管网水作为对照。盆栽试验用土为乌鲁木齐市明珠花卉市场的黑钙型土壤。
1.2 试验方法
蔬菜的品种选用四季嫩爽小白菜，花盆每盆装土8 kg，每盆留苗4株，自2015年7月28日起用处理溶液进行浇灌，每3天灌溉1次，每次每盆均匀灌水1 kg，可使盆栽充分灌溉。设置四种处理：清水、清水+Cd、再生水、再生水+Cd（Cd2+=0.05 mg·L-1，用CdCl2配置），每处理重复4次。分别在灌溉0，4，9次后取土样，9次灌溉后收获。
1.3 供试水样采集及其理化性质
对用于灌溉的再生水及对照所用的清水进行检测，检测项目及方法：pH值、硝酸盐氮—紫外分光光度法；化学需氧量—重铬酸钾法测定；悬浮物、总盐量—重量法；总氮—碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法；总磷—钼酸铵分光光度法；氨氮—纳氏试剂比色法。水样基本理化性质见表1。
与《农田灌溉水质标准（GB5084-2005）》相比，再生水中化学耗氧量超标。
1.4 土壤理化性质
土壤理化性质检测项目及方法：有机质—重铬酸钾外加热法；pH值、硝酸盐氮—紫外分光光度法；碱解氮—扩散法；TP和TN—H2SO4-H2O2消煮法[6]；土壤理化性质见表2。
1.5 检测指标与方法
土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法测定，以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克量表示；测定蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法，用24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克数表示；碱性磷酸酶活性采用苯磷酸二钠比色法测定，以每克土壤的酚毫克数表示[6]。
磷脂脂肪酸测定主要参照Bossio and Scow的方法[11]。在气相色谱仪（Agilent 6890N）上采用MIDI软件系统进行分析，测定PLFA各组分的含量。
式中，RF和R分别是标准物质的响应系数和峰值面积。312.54是内标物的分子量，8是土壤上样量。
对脂肪酸进行系统命名用 Tunlid和White[12]的方法。不同微生物相对应的PLFA标记见表3。
1.6 数据处理
试验数据采用Microsoft Excel 2007及SPSS22.0进行分析，采用Origin7.5作图。
2 结果与分析
2.1 不同灌溉处理对蔬菜根际土壤酶活性的影响
2.1.1 不同灌溉处理对小白菜根际土壤脲酶活性的影响 脲酶可水解尿素生成氨和二氧化碳，对土壤中氮的转化，尤其是对尿素的利用率等有非常重要的影响，也是土壤中分解酰胺态氮的酶，活性可以反映出土壤无机氮的供应能力[15]。
如图1所示，随着灌溉次数的增加，土壤脲酶活性呈先上升后下降的趋势：从0次灌溉到4次灌溉脲酶活性增长近14倍，而9次灌溉时脲酶活性为4次灌溉时的一半。0次灌溉时小白菜土壤脲酶活性最低并且土壤脲酶活性显著低于其他两次灌溉。小白菜在4次灌溉即生长期土壤脲酶活性最大。在收获期脲酶活性表现为：清水+Cd灌溉>清水对照，再生水+Cd灌溉>再生水灌溉。但在同种灌溉次数下，4种不同处理之间无显著差异。
2.1.2 不同灌溉处理对小白菜根际土壤蔗糖酶活性的影响 蔗糖酶能够把土壤中高分子量的蔗糖分子分解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖能够被土壤微生物和植物吸收利用，从而将充分的能源供给土壤生物体，其活性能够反映土壤分解转化和有机碳累积的规律，影响着土壤的碳循环。周礼恺[16]认为蔗糖酶活性更多的取决于有机质的类型，因此也应考虑不同植被对土壤酶活性的影响。
如图2所示，在对小白菜灌溉过程中，土壤蔗糖酶活性均表現为：4次灌溉>9次灌溉>0次灌溉，小白菜0次灌溉和9灌溉时期，4种不同灌溉处理方式下的酶活性无显著差异，但在4次灌溉即蔬菜生长期，不同灌溉方式对土壤蔗糖酶活性的影响有显著差异。蔗糖酶酶活性从大到小为再生水+Cd>再生水>清水>清水+Cd，且再生水+Cd处理显著高于其他三种处理的土壤蔗糖酶活性。
2.1.3 不同灌溉处理对小白菜根际土壤磷酸酶活性的影响 土壤磷酸酶是对农业生产有重要影响的一种酶，在土壤磷素循环及土壤环境的磷转化中起到重要作用[17]。土壤磷酸酶活性是衡量土壤肥力，特别是有效磷水平的一个重要指标。
如图3所示，0次灌溉到4次灌溉小白菜土壤碱性磷酸酶活性增长近25倍，4次灌溉到9次灌溉之间碱性磷酸酶活性变化不大。
在相同灌溉次数下：0次灌溉时4种处理间的土壤碱性磷酸酶差异不显著，4次灌溉时清水与清水+Cd处理之间差异显著（P<0.05），其他处理之间无显著差异；9次灌溉时再生水处理与其他三种处理之间差异显著（P<0.05），且清水+Cd和再生水+Cd处理显著高于清水处理。再生水+Cd处理始终低于再生水处理后的小白菜土壤碱性磷酸酶活性。
2.2 不同灌溉处理对小白菜根际土壤各微生物类群含量及微生物生物量的影响
蔬菜收获期4种不同灌溉处理小白菜根际土壤各微生物类群含量及微生物生物量的影响见表4。
表4 所示，小白菜收获期4种不同处理灌溉其根际土壤中PLFA的含量，清水处理与再生水处理之间有显著差异（P<0.05），根际土壤中PLFA含量大小表现为：再生水>再生水+Cd>清水>清水+Cd，用再生水灌溉，土壤微生物的生物量最大，是清水灌溉的1.15倍。再生水+Cd灌溉小白菜，土壤微生物生物量比再生水灌溉降低了0.33 nmol·g-1，但仍高于清水对照。清水+Cd灌溉其根际土壤微生物的生物量小于清水对照。得出再生水灌溉有利于小白菜根际土壤微生物各类群数量的增加，但随着Cd的添加，小白菜根际土壤微生物的生物量有减少趋势，Cd表现出了对土壤微生物的抑制作用，但差异并不显著。
小白菜4种不同灌溉处理根际土壤微生物类群都表现为G->G+>放线菌>真菌。再生水处理与清水处理的G-生物量存在显著差异（P<0.05），其变化趋势与总PLFA相同。再生水灌溉小白菜，G-的生物量是对照的1.29倍，再生水+Cd灌溉，G-的生物量是对照的1.21倍，清水+Cd灌溉，G-生物量小于清水对照0.06 nmol·g-1，G-受再生水的影响比其他各类群显著。G+生物量的表达在4种灌溉方式下的表现为再生水+Cd>再生水>清水>清水+Cd，且再生水灌溉与清水对照之间差异显著（P<0.05），加Cd和不加Cd之间无显著差异，真菌和放线菌的生物量也表现出了此规律。
2.3 不同灌溉处理对小白菜根际土壤微生物群落结构的影响
不同处理的根际土壤均含有不同的脂肪酸单体，其质量分数见图4。
本次试验共检测到47种单体成分。不同灌溉处理检测到的单体分别是：再生水处理最多，含45种，再生水+Cd处理43种，清水对照42种，清水+Cd处理最少，检测到41种。含量大于1的脂肪酸单体依次为：a15：0 、i15：0 、16：1 w7c、16：1 w5c、16：00、10me16：0 、i17：1 w5c、17：0 cyclo、18：1 w9c、18：1 w7c、18：00、19：0 cyclo w8c。大多数的单体在不同处理中的含量均表现为再生水>再生水+Cd>清水>清水+Cd。其中再生水对单烯类脂肪酸14：1 w5c，饱和脂肪酸i14：0、14：0、15：0、a17：0，不饱和脂肪酸a15：1以及羟基类脂肪酸16：1 2OH的影响较大，用再生水灌溉的小白菜，以上单体含量均大于清水灌溉。单体i14：0、13：0 2OH、a15：1、16：00、17：00、18：00受Cd的影響较大，用含Cd的溶液灌溉的小白菜，以上单体含量均小于清水灌溉。
3 结 论
土壤酶在生态环境中有着非常重要的地位，沈桂琴等研究表明，重金属Cd对土壤转化酶、脲酶以及碱性磷酸酶的活性有明显的抑制作用[18]。本试验研究表明，小白菜在4次灌溉即处于生长中期时，4种不同处理灌溉方式下的土壤脲酶和蔗糖酶均表现为最大值，值得一提的是在蔗糖酶中，再生水与清水灌溉之间存在显著差异，且再生水+Cd处理下的蔗糖酶活性显著大于再生水灌溉，这可能是由于小白菜在生长过程中对土壤中各养分的需求量较大，土壤微生物结构复杂，再生水中总氮和氨氮的含量高于清水中的含量，导致酶活性的差异较大，而Cd的添加刺激了蔗糖酶活性增大。
在小白菜收获期，土壤脲酶和蔗糖酶与生长期相比均有不同程度的下降，清水+Cd与清水灌溉相比表现出了抑制脲酶和蔗糖酶的活性。与清水对照相比，再生水灌溉和含Cd溶液的加入分别表现出了促进和抑制了碱性磷酸酶活性的作用。小白菜收获时期的土壤微生物群落结构研究表明，PLFA的含量在不同处理下差异显著，表现为再生水>再生水+Cd>清水>清水+Cd，再生水灌溉增加了微生物各类群的含量，用含Cd的溶液灌溉对微生物各类群的含量及单体的数量均有不同程度的抑制作用。土壤酶活性与微生物各类群PLFA的含量之间相互作用、相互影响，土壤酶大多数来源于微生物分泌和植物根系，再生水对微生物的影响较大，再生水促进了微生物各类群PLFA的含量以及单体数量，因此对土壤酶活性产生了一定的影响。同理，重金属Cd抑制了土壤微生物各类群PLFA的含量，同时也影响了土壤酶活性在不同处理间存在的差异。
参考文献：
[1]陈卫，吕斯丹，张炜铃， 等.再生（污）水灌溉生态风险与可持续利用[J].生态学报，2014，34（1）：163-172.
[2]苗战霞，黄占斌，侯利伟，等.再生水灌溉对玉米和大豆抗氧化酶系统的影响[J].农业环境科学学报，2007，26（4）：1338.
[3]易治伍，王灵，钱翌， 等.乌鲁木齐市农田土壤重金属含量及评价[J].干旱区资源与环境，2009，23（2）：150.
[4]曾路生，廖敏，黄昌勇， 等.镉污染对水稻土微生物量、酶活性及水稻生理指标的影响[J].应用生态学报，2005，16（11）：2162-2167.
[5]鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京：中国农业出版社，2000.
[6]关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1986：274-340.
[7]周礼恺，张志明，曹承绵，等.土壤的重金属污染与土壤酶活性[J].环境科学学报，1985，5（2）：176-184.
[8]王新，周启星.土壤重金属污染生态过程、效应及修复[J].生态科学，2004，23（3）：278-281.
[9]祁建军，姚槐应，李先恩.磷脂脂肪酸法分析地黄土壤根际微生物多样性[J].土壤，2008，40（3）：448-454.
[10]刘波，胡桂萍，郑雪芳，等.利用磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记法分析水稻根际土壤微生物多样性[J].中国水稻科学， 2010， 24（3）：278-288.
[11]周勇，郑璐雨，朱敏杰.内生真菌感染对禾草宿主生境土壤特性和微生物群落的影响[J]. 植物生态学报，2014， 38 （1）： 54-61.
[12]BOSSIO D A， SCOW K M. Impacts of carbon and flooding on soil microbial communities.Phospholipid fatty acid profiles and substrate utilization patterns[J].Microb， 1998，35：265-278.
[13]毕明丽，宇万太，姜子绍，等. 利用PLFA方法研究不同土地利用方式对潮棕壤微生物群落结构的影响[J]. 中国农业科学， 2010， 43（9）：1834-1842.
[14]WASEEM A， ARSHAD J， IQBAL F， et al. Pollution status of pakistan： a retrospective review on heavy metal contamination of water， soil， and vegetables[J]. Biomed research international， 2014：813206-813206.
[15]孔繁翔.环境生物学[M].北京：高等教育出版社，2000.
[16]周礼恺.土壤酶活性的总体在评价土壤肥力水平中的作用[J].土壤学报，1983，20（4）：413.
[17]王黎明，徐冬梅，陈波，等.外来污染物对土壤磷酸酶影响的研究进展[J].环境污染治理技术与设备，2004，5（5）：12-17.
[18]沈桂琴，廖瑞章.重金属、非金属、矿物油对土壤酶活性的影响[J].农业环境科学学报，1987（3）：26-29.