雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析
[摘要] 该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1 797 bp，编码579个氨基酸，相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明，TwMS具有单萜合酶的特征结构域，属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示，经茉莉酸甲酯（MeJA）诱导后，TwMS的相对表达量显著上调，并在24 h达到最高。此外，该研究在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达TwMS蛋白，为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
[关键词] 雷公藤； 单萜合酶； 生物信息学分析； 基因表达分析； 蛋白表达
Cloning and protein expression analysis of monoterpene synthase gene TwMS in Tripterygium wilfordii
HU Tianyuan1， SU Ping2， ZHANG Yifeng1，2， GUAN Hongyu 1，2， ZHOU Jiawei1 ，
TONG Yuru1，2， GAO Wei1*， HUANG Luqi2
（1.Key Laboratory of Collateral Diseases， School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University，
Beijing 100069， China；
2.State Key Laboratory of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， Chinese
Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract] In this study， we cloned a monoterpene synthases， TwMS from Tripterygium wilfordii suspension cells. TwMS gene contained a 1 797 bp open reading frame （ORF）， encoding a polypeptide of 579 amino acids， which deduced isoelectric point （pI） was 6.10 and the calculated molecular weight was 69.75 kDa. Bioinformation analysis showed that the sequence of TwMS was consistent with the feature of monoterpene synthases. Differential expression analysis revealed that the relative expression level of TwMS increased significantly after being induced by methyl jasmonate （MeJA）. The highest expression level occurred at 24 h. TwMS protein was successfully expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）， which laid the foundation for identifying the function of T. wilfordii monoterpene synthases.
[Key words] Tripterygium wilfordii； monoterpene synthases； bioinformatics analysis； mRNA expression analysis； protein expression
中藥雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.来源于卫矛科植物雷公藤的根或根的木质部，具有祛风除湿、通络止痛、活血消肿，杀虫解毒等功效。现代研究表明，雷公藤的药用活性成分萜类物质具有显著的抗炎、抗肿瘤、调节免疫等药理活性[1]，其主要活性成分包括二萜类成分雷公藤甲素和三萜类成分雷公藤红素等。其中雷公藤甲素可有效抑制肿瘤细胞生长，对胰腺癌的治疗效果显著[23]，此外，雷公藤甲素还具有神经营养活性，是治疗帕金森和老年痴呆等疾病的重要活性分子[45]。雷公藤红素除了具有神经保护作用和抗遗传性疾病等作用外，近年来还被报导是一种瘦素增敏剂，可以起到减肥的作用[6]。
单萜化合物是由2个异戊二烯结构单元组成的链状或环状化合物，广泛存在于植物挥发油和树脂中[7]。 单萜化合物多具有较强的香气和生物活性，在植物种群竞争、吸引昆虫传粉、防御植食性动物和控制病虫害发生等方面发挥着重要作用[810]。植物单萜由质体内的4磷酸2甲基赤藓糖 （2CmethylDerythritol4phosphate，MEP）途径合成，其前体物质为牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）。单萜合酶 （monoterpenesynthases，monoTPS）是单萜生物合成的关键酶，单萜合酶基因的表达是植物生长发育过程中所必须的，具有明显的时空表达规律，其基因家族的不同成员往往在组织或器官的特定发育阶段表达，以合成植物通讯和生物防御所需的化感物质[1112]。单萜合酶基因的表达对环境的影响极为敏感，生物胁迫等外在压力可激活单萜合酶基因表达生成相应的单萜化合物，以对付食草动物、病虫害和病原菌等，很多单萜是植物防御系统的重要组成部分[10，13]，对植物的生长发育具有重要意义。