制何首乌对大鼠肝脏P450酶5种亚型mRNA表达的影响
[摘要]考察制何首烏水提物作用后大鼠肝脏P450酶5种亚型的mRNA表达变化。SD大鼠随机分为正常对照组、制何首乌高、低剂量组（540，108 g·kg-1），连续灌胃给药7 d。给药结束后，检测大鼠血清生化指标，并采用实时荧光定量PCR测定各实验组大鼠肝脏P450酶5种亚型mRNA表达。实验结果显示AST在高、低剂量组都显著下降；ALT在低剂量组显著降低，在高剂量组显著升高。高、低剂量组的大鼠肝组织P450酶5种亚型mRNA的表达均下调，且下调程度与给药剂量成一定的剂量性依赖。特别是高剂量制何首乌水提物能够显著抑制大鼠的CYP1A2和CYP2E1的mRNA表达。该研究发现大剂量制何首乌水提物具有肝毒性，且随着剂量增加其肝损伤程度增加。其中制何首乌水提物540 g·kg-1对大鼠肝CYP1A2和CYP2E1的mRNA的表达有明显抑制作用。
[关键词]制何首乌水提物； 肝损伤； P450酶； 血清生化指标； mRNA表达
Effect of processed Polygonum multiflorum on mRNA
expression level of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver
HUANG Chunlian1，2， FAN Xuemei2*， LI Qian3， WANG Yiming2， WANG Shumei1， GONG Mengjuan1*， LUO Guoan1，2
（1School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；
2 Department of Chemistry， Tsinghua University， Beijing 100084， China；
3 Guangzhou Consun Pharmaceutical Co， Ltd， Guangzhou 510610， China）
[Abstract]To observe the effect of processed Polygonum multiflorum on mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver SD rats were randomly divided into the normal control group， processed P multiflorum high dose and low dose groups （540 g·kg-1 and 108 g·kg-1） The rats in administration groups were continuously given with processed P mutiflorum for 7 days by ig administration， and the rats in normal control group were given with the same volume of distilled water After successive administration of 7 days， the serum biochemical indications were detected， and Realtime quantitative PCR technology was used to detect the mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver Experimental results showed that AST was decreased significantly in both low and high dose groups ALT was significantly decreased in low dose group and significantly increased in high dose group The mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver were decreased in high dose and low dose groups in a dosedependent manner Especially the high dose processed P multiflorum could significantly inhibit CYP1A2 and CYP2E1 mRNA expression levels in rats The study showed that high dose P multiflorum water extract had hepatotoxicity， and the degree of liver damage was increased with the increase of dose It shall be noted that 540 g·kg-1 water extract of P multiflorum could significantly inhibit CYP1A2 and CYP2E1 mRNA expression levels in the liver of rats
[Key words]processed Polygonum multiflorum； liver injury； CYP450； serum biochemical indicators； mRNA expression
细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是人体内重要的药物代谢氧化酶，能够催化多种药物、前毒物、强致癌物等外源性物质的氧化还原代谢[1]。在生物转化过程中起到非常重要的地位。同时，它也会受到药物的影响[2]。近年来，CYP450在中药代谢方面逐渐受到人们的关注。研究中药作用于CYP450酶的表达，有助于预测临床药物相互间的作用，提高中药的疗效与安全性[3]。
何首乌是蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根，制何首乌为何首乌炮制加工而来，炮制后具有补肝肾、益精血、强筋骨的功效。从古到今常用作补药，在临床上多与其他药物配伍使用。但是近年来，临床上常见制何首乌能够引起肝脏损伤的报道[45]。本研究以制何首乌水提物为研究对象，考察其对大鼠肝脏CYP1A2，CYP2E1，CYP3A1（相当于人的CYP3A4），CYP2D6，CYP2C11（相当于人的CYP2C9）P450酶5种亚型的mRNA表达影响，有利于预测制何首乌与其他临床药物之间可能存在的相互作用，从而指导临床安全合理用药，降低潜在的风险。
1材料
11动物与分组清洁型雄性SD大鼠，体重（200±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）20120001，由清华大学实验动物中心分笼饲养（批准号16LAG2）。SD大鼠适应性喂养1周后，随机分成3组，每组6只：正常组（空白对照，给予蒸馏水）、制何首乌低剂量组（108 g·kg-1，相当于临床剂量10倍）和高剂量组（540 g·kg-1，相当于临床剂量的50倍）。灌胃给药，每天1次，连续给药7 d。
12试剂制何首乌水提取物由广州康臣药业基地中心提供（批号20160525）；Power SYBRGreen PCR Master Mix（美国ABI，批号1310428）；RNase free water（美国Invitrogen，批号3626C311）；Trizol Reagent（美国Invitrogen，批号94302）；10%水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司，批号20110210）；PBS（HyClone，美国，批号AAF203865）；生理盐水（山东华鲁制药有限公司，批号B16030706）；无水乙醇、氯仿、异丙醇（批号分别为20160502，0150232，20150508，北京化工厂）。
13仪器GSTORM基因扩增仪（英国）；ABI Prism 7300实时荧光定量PCR仪（美国）；XP205 型电子天平（Mettlertoledo，瑞士）；低温高速离心机（Hettich，德国）；生物分光光度计（Eppendorf，德国）。
2方法
21标本采集连续7 d给药结束后，禁食12 h，自由饮水，称各组大鼠体重。10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速打开腹腔肝门静脉取血，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清；然后迅速取大鼠肝脏，冰冷的生理盐水清洗，用滤纸吸干，称重，保存于液氮中。
22肝重指数的测定根据给药结束时大鼠的体重和肝重计算肝重指数，肝重指数=肝重/体重×100%。
23血清生化指标检测检测大鼠血清中的8个生化指标：谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）能敏感的反映肝细胞是否发生损伤及损伤程度；白蛋白/球蛋白（A/G）和总蛋白定量（TP）可反映肝合成功能；总胆红素（TBIL）可反映胆红素代谢及膽汁淤积情况；甘油三酯（TG）可反映脂质代谢异常；白蛋白（ALB）可反映蛋白代谢异常。碱性磷酸酶（ALP）可反映胆汁淤积性疾病。按试剂盒说明书全自动生化仪检测。
24肝脏组织总RNA的提取及浓度测定取液氮中冻存的大鼠肝脏组织50 mg置于已除RNA酶的研钵中，在液氮条件下研磨，按 Trizol RNA提取试剂盒操作说明提取各组大鼠肝脏组织中的总RNA。利用生物分光光度计测定提取总RNA的浓度及A值。总RNA样本的A260/A280均介于180～210即符合实验要求。
25引物设计及特异性验证考察基因GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1的引物使用Primer 30设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列信息和扩增产物长度见表1。
对看家基因GAPDH及CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A引物的特异性进行考察。
随机选择2个样本进行上述基因的实时荧光定量PCR（RTPCR）反应，若扩增产物的熔解曲线为单峰，则说明引物特异好，可以用于定量测定。
26RTPCR测定将大鼠肝组织提取的总RNA反转录合成cDNA。按下述体系进行RTPCR反应：10 μL Power SYBRGreen PCR Master Mix，上、下游引物各040 μL，cDNA 模板1 μL，Rnasefree Water 820 μL，总计20 μL。RTPCR反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循环40次。用RTPCR仪自带软件进行荧光定量分析，得出Ct，结果采用绝对定量法计算mRNA的表达量。首先建立各基因的浓度和Ct测定值的标准曲线，通过标准曲线分别计算出样本中各基因的拷贝值，然后根据看家基因进行归一化处理，计算结果使用目的基因与看家基因GAPDH拷贝数的比值表示。
27数据处理及统计学分析数据统计结果用±s表示。各组实验数据用SPSS 210统计软件进行单因素ANOVA分析，方差不齐采用非参数检验，P<005为差异有统计学意义。
3结果
31对大鼠肝重指数变化的影响各实验组大鼠肝重指数没有明显变化，说明制何首乌水提物对大鼠肝重没有影响。
32大鼠血清生化指标变化与正常对照组比较，ALT在低剂量组显著下降，而在高剂量组中显著升高；AST在高、低剂量组中都显著下降。说明给药剂量的不同对大鼠肝细胞造成不同程度的损伤。给药组大鼠血清中TBIL和ALP虽然有变化，但不显著。说明给药对大鼠胆红素代谢及胆汁淤积方面有一定的影响。不同给药剂量组大鼠血清生化指标A/G，TP，ALB，TG没有显著性的变化，说明药物对大鼠肝脏的合成功能，脂质代谢和蛋白代谢等方面无明显影响，见表2。
33引物特异性验证GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1基因RTPCR扩增产物的融解曲线都为单一特异性峰，证明实时荧光定量PCR中的荧光均为目的基因cDNA扩增双链DNA发出的荧光，引物特异好，可进行下一步定量测定。
34RTPCR定量测定采用绝对定量法对目的基因进行分析，建立了6个基因的标准曲线方程，分别为GAPDH：Y=-5299X+5259（R2=0999）；CYP1A2：Y=-4842X+571（R2=0994）；CYP2C11：Y=-4617X+571（R2=0998）；CYP2D4：Y=-4022X+521（R2=0990）；CYP2E1：Y=-4687X+5288（R2=0991）；CYP3A1：Y=-4555X+546（R2=0999）。其中Y为浓度，X为RTPCR测定的Ct。通过RTPCR测定得到的各样本中GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1基因的Ct，根据标准曲线方程计算其含量，并参照看家基因GAPDH进行归一化后，见表3。可以看出，与正常组相比较，不同剂量的制何首乌水提物均能够抑制大鼠肝组织中P450酶5种亚型的mRNA表达，且抑制程度与给药剂量成一定剂量依赖性。其中540 g·kg-1高剂量制何首乌水提物能够显著的抑制大鼠CYP1A2和CYP2E1的mRNA表达，而108 g·kg-1低剂量制何首乌水提物虽然也具有抑制作用，但与正常组比较，不存在显著性差异。
4讨论
制何首乌是临床中常用来乌发补益的中药。但近年来，屡见文献报道制何首乌可导致不良反应，特别是肝毒性[6]，严重威胁了患者临床的安全用药。目前国内、外对于制何首乌的肝毒性也在不断的深入研究[78]。本研究发现不同剂量的制何首乌给药短期可对大鼠的肝脏产生不同程度的损伤作用，并且能够抑制CYP450酶mRNA的表达，特别是对CYP1A2和CYP2E1的抑制作用显著，因此临床上需要注意制何首乌与其他药物联用时产生的不良后果。
本研究结果显示，大剂量制何首乌短期给药对大鼠的肝重指数没有影响，但血清生化指标测定发现给药后大鼠血清中ALT，AST，TBIL，ALP水平发生变化。ALT在高剂量组中显著性升高，说明高剂量何首乌造成了大鼠肝脏细胞的坏死，这与涂灿等[9]研究何首乌炮制前后对大鼠肝脏的损伤比较及敏感指标筛选的研究中肝细胞坏死导致ALT升高的结果相符。低剂量组ALT和高、低剂量组中AST都显著降低，表明肝组织发生慢性轻度损伤。李玥等[10]在观察制何首乌醇提物不同剂量长期给药对小鼠肝脏的影响结果中，ALT，AST在发生急性肝损伤、重度损伤时，ALT，AST明显升高，而发生慢性轻度损伤时，ALT，AST变化不明显或者可能发生显著下降。制何首乌高剂量组的大鼠血清中TBIL升高，肝脏将间接胆红素转化为直接胆红素的能力下降，说明肝细胞受损。与胡锡琴等[11]在研究何首乌鞣质对大鼠肝脏生化指标的影响结果中肝脏发生炎症、坏死、中毒等损害时引起血清TBIL升高的結果一致。TBIL病理性降低见于慢性肝炎和再生障碍性贫血。研究结果显示不同剂量制何首乌组的ALP相对于正常对照组都降低，ALP病理性降低，说明肝脏出现胆汁淤积或者慢性的肝损伤现象。
在此基础上，P450酶5种亚型mRNA的表达结果显示，高、低剂量的制何首乌水提物均能够抑制肝组织P450酶5种亚型mRNA的表达，且抑制程度与给药剂量成一定的剂量性依赖。特别是对CYP1A2和CYP2E1，高剂量的制何首乌显著抑制这2个酶的mRNA表达。李浩等[12]研究何首乌水提物对大鼠肝脏CYP1A2，CYP2E1酶活性及mRNA表达抑制作用研究；还有研究发现[13]，大鼠灌胃制何首乌90 d，可抑制大鼠肝脏CYP2E1 mRNA的表达。
本研究结合大鼠血清生化指标测定与肝组织P450酶5种亚型mRNA的表达的测定结果，表明制何首乌对mRNA表达水平的调控可能是其导致肝损伤的作用机制之一。制何首乌通过抑制P450酶5种亚型mRNA的表达，可能导致其酶活性降低，从而造成制何首乌中某些肝毒性成分在肝脏中积聚，导致肝组织出现不同程度的损伤。该研究结果有助于防范制何首乌用药引起的不良反应，并为临床安全用药提供实验依据。
[参考文献]
[1]Huang Q， Deshmukh R S， Ericksen S S， et al Preferred binding orientations of phenacetin in CYP1A1 and CYP1A2 are associated with isoformselective metabolism[J] Drug Metab Dispos， 2012， 40（12）： 2324
[2]于敏，张双庆，闻镍，等细胞色素P450酶系体外药物代谢研究方法进展[J]中国药事，2013， 27（1）： 81
[3]Mehra D， Sternberg D I， Jia Y， et al Altered lymphocyte trafficking and diminished airway reactivity in transgenic mice expressing human MMP9 in a mouse model of asthma[J]Am J Phys Med Rehabil，2010，298（2）：189
[4]衛培峰，胡锡琴，严爱娟何首乌所致不良反应概况[J]陕西中医，2004，25（2）：170
[5]罗瑞芝，贾伟，赵利斌，等何首乌研究进展[J]中草药，2005，36（7）：1097
[6]陈媛媛，郭芳，王文军，等丹参联合川芎嗪对肺纤维化大鼠肺组织JAK1， STAT1， ICAM1 表达的影响[J]泸州医学院学报，2012，35（1）：6
[7]张思玉，朱晓光，张广平，等制首乌提取液毒理学研究[J]毒理学杂志，2013，27（4）：261
[8]李晓菲，李娜，涂灿，等基于内毒素特异质模型的生首乌与制首乌肝毒性比较研究[J]中草药，2015，46（10）：1481
[9]涂灿，蒋冰倩，赵艳玲，等何首乌炮制前后对大鼠肝脏的损伤比较及敏感指标筛选[J]中国中药杂志，2015，40（4）：654
[10]李玥，徐立，刘若囡，等生、制首乌醇提物对小鼠肝脏的影响[J]海南医学院学报，2011， 17（4）： 452
[11]胡锡琴，李娅琳，王磊何首乌中鞣质对大鼠肝脏生化指标的影响[J]药物评价研究，2010（1）： 63
[12]李浩，杨红莉，李登科，等何首乌水提物对大鼠肝脏 CYP1A2， CYP2E1 酶活性及 mRNA 表达抑制作用研究[J]中国中药杂志，2015，40（7）：1370
[13]卫培峰，张敏，焦晨莉，等何首乌不同炮制品对大鼠肝脏CYP2E1基因 mRNA 表达的影响[J]中国医院药学杂志，2010， 30（17）：1445
[责任编辑张宁宁]
[收稿日期]20161011
[基金项目]国家自然科学基金项目（81130066，81302731）
[通信作者] *范雪梅，高级工程师， 主要从事分子药理学研究，Tel/Fax：（010）62781688，Email：xuemeifan@tsinghuaeducn；*龚梦鹃，副教授，主要从事中药药理研究，Tel/Fax： （020）39352612，Email：gongmengjuan@139com
[作者简介]黄春连，硕士研究生，Tel/Fax：（010）62781688，Email：738621544@qqcom