牡荆苷对脑缺血再灌注损伤小鼠抗氧化酶的影响
[摘要] 目的 研究牡荊苷对脑缺血再灌注损伤小鼠抗氧化酶的作用及机制。 方法 雄性昆明种小鼠70只，按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、牡荆苷组（10、20、40 mg/kg）、尼莫地平组（0.6 mg/kg），采用线栓法制备脑缺血再灌注模型，牡荆苷组在缺血再灌注前连续腹腔给予牡荆苷3 d，缺血再灌注后，每天给药1次，连续给药7 d，检测小鼠神经功能损伤评分，采用试剂盒法检测脑组织、血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、髓过氧化物酶（MPO）的活性。 结果 与假手术组比较，模型组神经功能损伤评分显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，牡荆苷组神经功能损伤评分显著降低（P < 0.01）。与假手术组比较，模型组脑组织、血清中MDA含量、MPO活性显著升高，SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和牡荆苷组脑组织、血清中MDA含量、MPO活性显著降低，SOD、GSH-Px、CAT活性显著增强，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。与尼莫地平组比较，10、20 mg/kg牡荆苷组MDA含量和MPO活性显著上升，SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低（P < 0.05）；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 牡荆苷对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用可能通过抗氧化作用来实现。
[关键词] 牡荆苷；脑缺血再灌注；抗氧化酶
[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0012-05
Effects of vitexin on antioxidant enzymes in cerebral ischemia-reperfusion injury mice
YAN Juan1 ZHENG Maodong1 CUI Yuhuan2 ZHAO Hongxiu1 ZHAO Xiuhua1 BAN Xuxia1
1.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou 075000， China； 2.Department of Geriatrics， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou 075000， China
[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of vitexin on antioxidant enzymes in cerebral ischemia-reperfusion injury mice. Methods Seventy Kunming male mice were randomly divided into the normal control group， sham group， model group， vitexin group （10， 20， 40 mg/kg） and Nimodipine group （0.6 mg/kg）. Mice were prepared with cereral ischemia-reperfusion injury by suture method. Vitexin was intraperitoneally injected three days before cerebral ischemia， after ischemia-reperfusion， mice were given drugs once daily for seven consecutive days， then neurological deficits were determined. The contents of malondialdehyde （MDA）， the activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， and myeloperoxidase （MPO） in brain tissue and serum were determined by the kits methods. Results Compared with sham group， the neurological score was remarkably increased in model group （P < 0.01）； compared with model group， the neurological scores in vitexin group were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with sham group， the content of MDA and the activity of MPO in model group were increased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px in brain tissue and serum were reduced， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with model group， the content of MDA and the activity of MPO of brain tissue and serum in Nimodipine group and vitexin group were decreased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px were strengthened， the differences were statistically significant （P < 0.01 or P < 0.05）. Compared with Nimodipine group， the content of MDA and the activity of MPO in 10， 20 mg/kg of vitexin group were increased， the activities of SOD， CAT， GSH-Px were reduced （P < 0.05）， there were no significant differences between 40 mg/kg of vitexin group and Nimodipine group （P > 0.05）. Conclusion Vitexin against cerebral ischemia-reperfusion injury might through its anti-oxidative effect.
[Key words] Vitexin； Cerebral ischemia-reperfusion； Antioxidant enzymes
随着我国社会步入老龄化阶段，脑血管疾病成为影响老年人生活质量的常见疾病，其中缺血性脑血管病最为常见，在其康复治疗中，首要恢复缺血区的血流供应，但随之而来的再灌注损伤也不能忽视。有多种发病机制参与脑缺血再灌注损伤过程，如氧化应激[1]、能量耗竭[2]、炎性反应和细胞凋亡[3]等，其中氧化应激是缺血再灌注损伤的重要机制，再灌注后导致反应性氧自由基过多，抗氧化酶不能清除体内过量自由基，导致神经元损伤及凋亡[4]，损伤脑组织正常功能，如何清除脑内自由基成为治疗缺血再灌注损伤的方法。牡荆苷是抗氧化活性较强的黄酮类化合物，牡荆苷是金莲花中主要药效成分，金莲花具有消肿明目、清热解毒的功效，临床上主要用于扁桃体炎、中耳炎及急性结膜炎、上呼吸道感染等[5]。现代药理研究发现，牡荆苷具有较强的体外抗氧化活性[6]。本研究探讨牡荆苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织、血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的活性的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
昆明种小鼠70只，雄性，体重（22±2）g，2月龄，由河北北方学院（以下简称“我校”）动物中心提供，自由饮水，室温（22.0±1.0）℃，湿度40%，实验动物生产许可证号：XCYK（冀）2010-2014。该方案经我校动物伦理委员会批准。牡荆苷由我校药物研究室提供，纯度>98%；SOD、MDA、CAT、MPO、GSH-Px测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 牡荆苷溶液的配制[7] 用N，N-二甲基甲酰胺溶解牡荆苷，加入吐温-80助溶，充分振荡混匀后，加入生理盐水，其比例为：N，N-二甲基甲酰胺∶吐温-80∶生理盐水= 1∶1∶20。
1.2.2 分组及模型制备 将70只小鼠按随机数字法分为正常对照组、假手术组、模型组、牡荆苷（10、20、40 mg/kg）组、尼莫地平组（0.6 mg/kg），每組10只。小鼠称重后，采用3.5%水合氯醛（10 mL/kg）进行腹腔麻醉，仰卧位固定于小鼠手术台上，按照文献[8]的方法制备脑缺血再灌注小鼠模型，并于术后48 h阻断两侧颈总动脉造成大脑缺血状态，5 min后恢复血液再灌注。假手术组手术过程与缺血再灌注组一致，但只暴露颈总动脉，血管开口后，线栓仅仅插入开口处，不导致血流阻塞。牡荆苷组在术前连续腹腔给予牡荆苷3 d，缺血再灌注后，每天给药1次，连续给药7 d。实验过程中小鼠的肛温维持在（37.0±0.4）℃，均不应用抗生素。动物如有死亡，及时补充。
1.2.3 动物模型的评价 成功标准：①身体明显不对称，步态不稳；②在45℃坡度无力爬行；③小鼠从尾部悬起，前肢不对称，肢体不运动；④前肢着于平面，提尾使后肢悬空，缓慢向一侧转圈，胡须对侧反应降低。
1.2.4 神经行为学评分 小鼠苏醒后，观察存活小鼠行为变化，于给药7 d后采用双盲法参考Clark评分标准评分[9]（0～28分）。
1.2.5 取材和抗氧化酶指标检测 给药7 d后，腹主动脉取血5 mL，用肝素抗凝，放入离心管中，4℃，11 000 r/min，离心10 min，吸取上清液放入冰箱中待测，再立即处死动物，放置于冰上，取出缺血侧脑组织，除去样本表面凝血等附属物，再经预冷生理盐水冲洗后，滤纸吸干表面水分，加9倍冰冷无菌的生理盐水制成10%的脑匀浆，4000 r/min离心10 min，吸取上清液放入冰箱中待测。上述血清和组织样本依次按照试剂盒方法测定SOD、CAT、GSH-Px、MPO活性和MDA含量。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 16.0软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 牡荆苷对脑损伤小鼠神经功能损伤评分的影响
正常对照组与假手术组神经功能损伤评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与假手术组比较，模型组神经功能损伤评分显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和牡荆苷组（10、20、40 mg/kg）神经功能损伤评分显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。10、20 mg/kg牡荆苷组神经功能损伤评分明显高于尼莫地平组（P < 0.05）；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。
与假手术组比较，**P < 0.01；与模型组比较，##P < 0.01；与尼莫地平组比较，△P < 0.05
图1 牡荆苷对脑损伤小鼠神经功能损伤评分的影响（n = 10）
2.2 牡荆苷对脑损伤小鼠MDA含量和MPO活性的影响
正常对照组与假手术组小鼠血清和脑组织中MDA含量和MPO活性比较差异无统计学意义（P > 0.05）；与假手术组比较，模型组小鼠血清和脑组织中MDA含量和MPO活性显著增加，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和牡荆苷组血清和脑组织中MDA含量和MPO活性显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。与尼莫地平组比较，10、20 mg/kg牡荆苷组MDA含量和MPO活性显著上升（P < 0.05）；40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结果提示，牡荆苷组可降低小鼠血清中MDA含量和MPO活性，以牡荆苷组（40.0 mg/kg）作用最为明显。见表1～2。
2.3 牡荆苷对脑损伤小鼠抗氧化酶活性的影响
正常对照组与假手术组小鼠血清和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT活性比较差异无统计学意义（P > 0.05）；与假手术组比较，模型组血清和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和牡荆苷组血清和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT活性显著增强，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。与尼莫地平组比较，10、20 mg/kg牡荆苷组SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低（P < 0.05），40 mg/kg牡荆苷组与尼莫地平组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结果提示，牡荆苷组可增强小鼠血清和脑组织中SOD、GSH-Px、CAT活性，以牡荆苷组（40.0 mg/kg）作用最为显著。见表1～2。
3 讨论
脑缺血再灌注损伤过程中氧化应激损伤、自由基损伤、氧化剂过剩、解毒系统失活、抗氧化剂不足等多种因素相互作用、相互影响[10]，每一环节发生变化都影响脑组织中抗氧化防御系统的正常功能[11]。因此，在脑缺血再灌注损伤治疗中抗氧化应激药物研究非常广泛[12]。大量的氧自由基进攻细胞内各种酶以及细胞膜上不饱和脂肪酸，进而在细胞内发生过氧化反应，使细胞结构和功能受损，诱导蛋白质、RNA、DNA的交联，引起生物膜裂解，最终导致酶失活性、蛋白质变性以及神经元死亡或凋亡[13]。脑缺血再灌注时，虽然可缓解脑的缺血缺氧状态，但与此同时也产生过量自由基，而体内抗氧化防御系统清除能力未大幅度提高，使自由基大量聚集，进一步加重脑组织损伤[14]。
机体内存在两类抗氧化系统：一种为酶抗氧化系统，包括SOD、CAT、GSH-Px酶等；另外一种为非酶抗氧化系统，包括维生素、微量元素硒等。在正常生理条件下氧化系统与抗氧化系统处于平衡状态。脂质过氧化反应的产物主要为MDA，其含量可直接反映脂质过氧化的程度、氧自由基水平、血管损伤程度[15]。SOD是一类金属酶，分为Mn-SOD、Cu.Zn-SOD与Fe-SOD可清除自由基，阻止脂质过氧化反应，在正常条件下，内皮细胞产生的SOD可特异性清除O2-，使O2-发生歧化反应生成H2O2和O2，减少O2-毒性作用[16]。GSH-Px催化H2O2分解，特异性催化还原型谷胱甘肽对H2O2的还原反应，起保护细胞膜结构完整和功能完整的作用[17]。CAT能夠将大量H2O2分解成水和分子氧，或催化H2O2被供氢体分子所提供的O2-还原，阻止脂质过氧化反应的一级引发作用，使机体减少有机氢过氧化物损伤[18]。因此，SOD、GSH-Px、CAT活力的高低反映了机体清除自由基的能力。MPO是主要存在于中性粒细胞，由中性粒细胞分泌的血红素蛋白酶，是中性粒细胞激活与功能的标志。MPO中性粒细胞移动到炎症部位，释放出MPO、氧自由基、弹性蛋白酶，产生氮自由基[19]。MPO功能包括杀灭、吞噬细胞内微生物，也可被释放到细胞外，破坏肿瘤细胞、毒素、细胞、血小板等，调节炎性反应[20]。脑缺血再灌注损伤过程是一个复杂的过程，自由基大量增加，攻击不饱和双键，由于自由基防御功能减弱，进而自由基与抗自由基酶之间平衡失调，将使脑组织更易受到自由基的攻击，破坏血脑屏障、血管通透性，加重脑水肿和神经元损害。
本研究结果显示，脑缺血再灌注损伤后小鼠脑组织和血清中SOD、CAT、GSH-Px活性明显降低，MDA含量和MPO活性增加，牡荆苷能显著增强模型组小鼠脑组织和血清中SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量和MPO活性，表明脑缺血再灌注损伤后氧化产物显著增加，清除自由基的主要活性酶活性显著下降，抗氧化能力降低；牡荆苷可减少自由基的产生，减轻脂质过氧化反应，表现出良好的抗氧化损伤作用。
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（收稿日期：2016-08-19 本文编辑：张瑜杰）