Garviecin,LG34抗菌机理研究

材料与方法

1.1 試验材料

1.1.1 Garviecin LG34

将Lactococcus garvieae LG34 斜面菌种 1～2 环转接到装有10 mL MRS 液体培养基的试管中混合均匀，于 28～30 ℃条件下培养18 h，按2%接种量接入装有200 mL的MRS液体培养基中，于30 ℃条件下发酵36 h。将发酵液离心（6 000 r/min，15 min），将上清液的pH值调整至7.0，用旋蒸仪浓缩10倍。用4倍冷乙醇沉淀处理，取上清液用旋蒸仪浓缩至原体积 的1/2。

1.1.2 指示菌

金黄色葡萄球菌ATCC 63589，黑龙江八一农垦大学微生物实验室保藏。

1.2 试验方法

1.2.1 Garviecin LG34对细胞内K+渗漏的影响

将金黄色葡萄球菌ATCC 63589过夜培养的菌悬液，加入Garviecin LG34，终浓度为320 AU/mL。于37 ℃条件下放置，隔20 min取样，菌液于0 ℃条件下以转速10 000 r/min离心7 min。采用M5型原子吸收光谱仪测定上清液中的K+浓度。

1.2.2 Garviecin LG34对260 nm紫外吸收物质渗漏的影响

将处于对数期的10 mL OD600为0.8～1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用320 AU/mL细菌素Garviecin LG34处理，在37 ℃条件下处理0，20，40，60，80，100 min后，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，上清液经0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌。于波长260 nm处测定细胞悬浮液的吸光度，以菌体悬浮在不含细菌素的纯净水中作为空白对照[5]。

1.2.3 Garviecin LG34对280 nm紫外吸收物质渗漏的影响

将处于对数期的10 mL OD600为0.8～1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用320 AU/mL细菌素Garviecin LG34处理，在37 ℃条件下处理0，20，40，60，80，100 min后，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体，上清液经0.2 μm的微孔滤膜过滤除菌。于波长280 nm处测定细胞悬浮液的吸光度，以菌体悬浮在不含细菌素的纯净水中作为空白对照[5]。

1.2.4 Garviecin LG34对细胞内核酸类物质渗漏的影响

处于对数期的10 mL OD600为0.8～1.0的金黄色葡萄球菌ATCC 63589，以转速6 000 r/min离心15 min离心收集菌体，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5灭菌磷酸缓冲溶液清洗2次。然后用抑菌Garviecin LG34处理，在37 ℃条件下处理30 min和60 min后，以转速6 000 r/min离心15 min收集菌体。以菌体悬浮在不含Garviecin LG34的纯净水中作为空白对照，以碘化丙啶（PI）为染色剂，用流式细胞仪分析试验样品与对照样品的PI荧光强度[6]。

2 结果与讨论

2.1 Garviecin LG34对细胞内K+渗漏的影响

细胞内K+是否大量渗漏到细胞外，能反映其细胞通透性的提高，为了研究Garviecin LG34对细胞通透性的影响，试验研究了细菌素作用金黄色葡萄球菌后细胞内K+渗漏的情况。

对金黄色葡萄球菌细胞内K+泄露的影响见图1。

由图1可知，细菌素Garviecin LG34作用金黄色葡萄球菌20 min以后，细胞内的K+大量渗漏到细胞外，与空白对照相比差异显著；作用80 min后，渗漏减慢。

2.2 Garviecin LG34对细胞内260 nm紫外吸收物质渗漏的影响

核酸类物质的最大吸收峰为260 nm，核酸物质的渗漏情况能反映出细胞膜上大孔洞的形成情况，因此试验研究了Garviecin LG34对金黄色葡萄球菌细胞内260 nm紫外吸收物质渗漏的影响。

对金黄色葡萄球菌细胞内260 nm紫外吸收物质泄露的影响见图2。

核酸最大吸收波长为260 nm，于波长260 nm处的光密度通常被用来评价核酸的浓度。由图2可知，用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌40 min后，于波长260 nm处的ΔOD显著高于用蒸馏水处理的空白样品。结果表明，用Garviecin LG34处理后，细胞内260 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。

2.3 Garviecin LG34对细胞内280 nm紫外吸收物质渗漏的影响

蛋白质的最大吸收波长为280 nm，因此在280 nm的光密度通常被用来评价蛋白质的浓度，细胞内蛋白质的渗漏情况能反映出细胞膜上大孔洞的形成情况，因此试验研究了Garviecin LG34对金黄色葡萄球菌细胞内280 nm紫外吸收物质渗漏的影响。

对金黄色葡萄球菌细胞内280 nm紫外吸收物质泄露的影响见图3。

由图3可知，用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌40 min后，于波长280 nm处的ΔOD显著高于用蒸馏水处理的空白样品。这些结果表明用Garviecin LG34处理后，细胞内280 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。

2.4 流式细胞仪测定细胞的通透性

流式细胞仪目前被广泛用于细胞损伤的研究中，主要的评价指标为平均通道荧光强度（MnX）。试验研究了用Garviecin LG34处理金黄色葡萄球菌对细胞通透性的影响。

用Garviecin LG34处理后金黄色葡萄球菌的平均通道荧光强度见表1。

由表1可知，用Garviecin LG34处理30 min和60 min后，MnX从2.66分别提高到5.23和6.43。这说明Garviecin LG34的处理导致了金黄色葡萄球菌细胞中碘化丙锭掺入量的增加，说明细胞膜的渗透性增大，在细胞膜上形成了较大的孔洞。

3 结论

细菌素Garviecin LG34作用金黄色葡萄球菌20 min以后，细胞内的K+大量渗漏到细胞外，与空白对照相比差异显著；在作用80 min后，渗漏减慢。用Garviecin LG34处理后，细胞内260 nm和280 nm紫外吸收物质可以大量渗透到细胞外。用Garviecin LG34处理30 min和60 min后，MnX从2.66分别提高到5.23和6.43。这说明Garviecin LG34的处理导致了金黄色葡萄球菌细胞中碘化丙锭掺入量的增加，说明细胞膜的渗透性增大，在细胞膜上形成了较大的孔洞。

参考文献：

刘国荣，李平兰，王成涛. 乳酸菌细菌素作为天然生物防腐剂在食品工业中的应用进展[J]. 北京工商大学学报（自然科学版），2012（2）：64-69.

丹彤，张和平. 乳酸菌细菌素的分类、生物合成及其应用[J]. 中国乳品工业，2013，41（3）：29-32.

Yurong Gao，Dapeng Li，Shan Liu，et al. Garviecin LG34，a novel bacteriocin produced by Lactococcus garvieae isolated from traditional Chinese fermented cucumber[J]. Food Control，2015（5）：896-899.

劉姗，高玉荣. 格氏乳球菌素LG34生物稳定性的研 究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（3）：67-70.

翟培，韩晋辉，侯丽霞，等. 家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探[J]. 中国生物工程杂志，2006，26（11）：33-39.

乔长庚. 温和压力对酵母活性与犁头霉生物转化的影 响[D]. 天津：天津科技大学，2005.

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