基因组编辑系统CRISPR—Cas9研究进展及其在猪研究中的应用
摘要：规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）及其相关的蛋白（Cas）原本是细菌抵御病毒的获得免疫系统，人们很快发现其应用潜力，即RNA引导的核酸酶Cas9对靶DNA进行基因组编辑：敲除、敲入、敲降。CRISPR-Cas9是继ZNF、TALENS技术之后的第三代基因组编辑技术，具有突变效率高、成本低、制作简单、能够诱导多位点同时突变等特点。除了基因工程功能外，CRISPR-Cas9系统还具有基因调控、基因组标记功能、大片段删除、全基因组扫描与编辑RNA等，且发展到CRISPR3.0，并继续开发其新应用。从2012年底开始，CRISPR的一系列创新性应用开启了整个基因组编辑研究的革命，成为生命科学领域的技术明星。文章对其最新进展进行了综述，并对其在猪中的应用及潜力进行了展望。
关键词：基因组编辑；CRISPR-Cas9；猪；基因功能；网络调控
中图分类号：R34；S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6510-07
最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分类表将其描述为三大类型和多个亚型，结合生物化学与分子遗传学方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）类型的特征[1]，其中II型系统Cas9比其他更为简便。基于CRISPR-Cas9系统的作用原理，研究人员模拟细菌的成熟crRNA和tracrRNA，在体外人工合成gRNA（guide RNA），同样可以达到特异地切割靶标DNA，从而将该系统简化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA两个组分，在靶标位点导致所期望的插入、删除或替换，由此开创了新型基因编辑技术，这是该系统的“基因工程功能”。更进一步地，通过点突变得到缺乏核酸酶活性的Cas9突变体，命名为dCas9。突变的dCas9可在gRNA的引导下，实现与DNA结合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合异源模块的结构域，利用dCas9这3点特性，将其与一系列具有功能的异源模块融合，实现不同研究目的：转录激活与抑制、探索未知基因及其调控元件的功能、全基因组扫描等，这是该系统的“基因调控功能”。不论是基因工程/基因调控，其工作过程是相同的：gRNA通过序列互补原则将核酸酶带到基因组特定位点，使其与靶标结合。不过，基因工程与基因调控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9与人工突变的dCas9蛋白，以实现各自目的[2，3]。该技术能够快速地构建遗传改造的动物，使得在过去要花费数月或数年的工作现在只需几周完成。CRISPR技术与PCR技术类似，正在给生物工程研究带来革命性的改变，从各个方面影响着生命科学的发展[4]。目前基因组编辑CRISPR-Cas中也主要是应用Cas9系统，下面简称“Cas9系统”。
2013年初以来，Cas9系统的快速创新及其拓展应用，使其成为可替代ZFN和TALEN的第三代基因组编辑工具。2013年Science杂志将Cas9系统选为年度十大突破之一（亚军）；2014年美国加州大学伯克利分校生物化学家Doudna博士和德国的Charpentier博士因此共同获得了美国硅谷“科技突破奖”与“阿尔珀特奖”；2015年被Science杂志评选为年度十大突破之首；2016年具有小诺贝尔奖之称的盖尔德纳国际奖授予了三位科学家：Doudna，Charpentier和麻省理工学院的张锋三位博士。几大公司看好Cas9系统的成果商业化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已经收到数亿美元的投资。例如，2015年比尔·盖茨等大佬宣布为促进基因编辑技术的蓬勃发展，共投资1.2亿美元参与基因编辑公司 Editas Medicine的B轮融资，Cas9先驱之一张锋是该公司的联合创始人。Editas Medicine计划于2017年采用基因编辑疗法对先天性黑蒙症进行临床试验，这是一种罕见的视网膜疾病，基因突变可能导致眼睛中的感光细胞逐渐消失。据麻省理工學院Broad研究所网站最新报道，农业生物技术巨头杜邦（DuPont）公司宣布对Caribou Sciences公司进行投资，且将获得其专利在农作物使用的独家授权。而Caribou Sciences是Cas9技术首创之一Doudna博士实验室的附属公司。目前，杜邦公司正在温室中种植Cas9编辑的玉米、大豆、水稻和小麦，期望在5～10年内出售Cas9技术的产品。位于明尼苏达州圣保罗的动物生物科技公司Recombinetics正在开发同类动物，包括无须抑制牛角生长的牛和不需要被阉割的猪。2016年6月底，美国国立卫生研究院（NIH）顾问委员会批准了一项申请：利用Cas9系统强化依赖于患者T细胞（一种免疫细胞）的癌症疗法。由于其易用性和通用性，Cas9已经被世界各地的实验室用来改写基因组和重塑细胞，其在医学和农业领域的潜在应用是无穷无尽的，它将开启该行业新一波的产品浪潮和利益追逐。根据瑞士洛桑附近的咨询机构IPStudies介绍，全球已有超过860项CRISPR专利，平均每天新增加一项专利。世界许多遗传学家和生化学家普遍认为，Cas9系统可对所有的生物进行改造，这是一项可改变生命未来的伟大技术，当然，该技术也面临许多伦理挑战。
1 CRISPR-Cas9系统的拓展性应用研究
最初的Cas9只能实现剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能执行一种功能的dCas9是CRISPR2.0。现在研究人员将突变dCas9蛋白与一系列具有功能的异源模块融合，成为能够执行多重功能的CRISPR3.0。这种平台能够执行复杂的程序，适用于研究基因网络机理和更深入探讨复杂性状/疾病[5]。
1.1同时激活多基因表达/同时抑制多基因