玉米赤霉烯酮对原代大鼠睾丸支持细胞增殖相关基因表达以及氧化应激的影响

材料与方法

1.1 材料

24日龄左右的清洁级雄性SD大鼠（南京市江宁区青龙山动物饲养场），ZEA（Sigma公司），DMEM/F12培养液，PBS缓冲液（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），胶原酶I（MP Biomedicals），胎牛血清（Gibco公司），Tris-HCl（Sigma公司），细胞培养箱（Thermo公司），Real-time PCR Master Mix （TaKaRa公司），二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司），TRIzol （TaKaRa公司），SYBR Green Master Mix（Vzayme公司），MTT检测试剂盒（杭州碧云天），油红O染料；超氧化物歧化酶（SOD）；GSH-PX检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），寡核苷酸引物由南京金维智有限公司合成。

1.2 原代大鼠睾丸支持细胞分离和培养[6-7]

采用颈椎脱臼法处死大鼠，将其全身浸泡于消毒乙醇后于无菌条件下取出睾丸，放入预冷的PBS中，剥离被膜、血管，随后PBS液冲洗2次。用眼科剪将曲细精管剪成约 1 mm3 碎块，转移至15 mL 离心管中；加入0.25% 胰酶和 0.1% 胶原酶Ⅰ各2 mL，37 ℃ 水浴振荡消化约30 min（观察到组织碎块消化至黏液状为准），加入2 mL含有血清的培养基吹打均匀，经100 μm筛网过滤后离心，去除上层清液。PBS洗1次后加入培养基 （DMEM/F12、15%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 U/mL），吹打细胞成细胞悬液；台盼蓝染色，计算细胞数，调整细胞密度为 3×105～5×105个/mL，接种于六孔培养板中，置于 CO2培养箱培养（95% 空气和 5% CO2，温度37 ℃），48 h后加入适量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）处理少许附着生精细胞，继续培养备用，隔天换液 1 次[8]。

1.3 油红O染色鉴定支持细胞[9]

Tris-HCl处理生精细胞24 h，吸取培养基后用 PBS冲洗1次；加入4%多聚甲酸固定30 min；滴加油红O染液，室温染色15～30 min；用浓度为75%的乙醇清洗多余染料；苏木素复染10～15 min，滴管吸取水洗至其变为蓝色，在光学显微镜下观察、拍照、记录。

1.4 ZEA对睾丸细胞的作用

将ZEA溶解于DMSO中，将纯化后的细胞培养24 h，换含有ZEA的培养基继续培养，终浓度为0、 50、 100、 125、 150 μmol/L，DMSO在每组中浓度不超过0.1%。

1.5 MTT检测细胞活性

将“1.2”节中提取的支持细胞培养24 h，加入适量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）处理少许附着生精细胞，继续培养24 h。加入不同浓度的ZEA（0、 50、 80、 100、 125、 150 μmol/L以及0.1%DMSO）100 μL培养20 h后，加入 20 μmol/L MTT溶液，继续培养4 h。随后终止培养，小心吸取孔内的培养液，每孔加入150 μmol/L DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。于酶联免疫检测仪D490 nm处测量各孔的吸光度。设置调零空白孔（培养基、MTT、DMSO），每个浓度组至少6个相同重复孔。0 μmol/L为标准组，其余浓度为试验组。计算公式如下：细胞活力=D试验-D空白D标准-D空白×100%。

1.6 荧光定量PCR检测相关基因mRNA水平的表达

将“1.4”节中用ZEA不同浓度培养的细胞培养20 h，按照传统TRIzol法提取细胞总RNA，D260 nm/D280 nm值为1.9～2.0，按照试剂盒说明书进行反转录，产物-20 ℃保存。引物见表1。定量仪器为StepOne，反应体系（20 μL）为：2 μL cDNA 模板，0.4 μL 上游引物，0.4 μL 下游引物，0.4 μL Rox，10 μL Taq MasterMix酶，6.8 μL DEPC水。反应条件为：95 ℃ 预变性5 min；循环反应95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。融解曲线条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.7 Westblot检测相关基因蛋白水平的表达

将“1.4”节中用ZEA不同浓度培养的细胞培养20 h，用RIAP裂解缓冲液提取细胞总蛋白，蛋白定量后取总蛋白 15～30 μg 进行SDS-PAGE电泳，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上，5%BSA封闭2 h，分别加Vimentin、CCND1（Santa Cruz Biotechnology，1 ∶500 TBST-BSA稀释）和 β-actin（Cell Signaling Technologies，1 ∶1 000 TBST-BSA稀释）兔抗鼠抗体，4 ℃ 过夜，TBST 洗 3次，每次 15 min。加入HRP 标记的羊抗兔IgG，室温下反应2 h，TBST 洗3次，每次 15 min。ECL 发光压片显色，扫描并分析图像。

1.8 氧化应激指标测定

将“1.4”节中培养的细胞上清液收集于2 mL EP管中，SOD检测反应通过黄嘌呤以及黄嘌呤氧化物反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计在550 nm处测其吸光度。SOD计算公式为：SOD=D对照组-D测定组D对照组×68 U/mL。

将“1.4”节中培养的细胞上清液收集于2 mL EP管中，GSH-PX 可以促进过氧化氢（H2O2）与还原性谷胱甘肽反应生成H2O以及氧化性谷胱甘肽（GSSG），可用其酶促反应速度来表示谷胱甘肽过氧化物的活性，测定此酶促反应中还原性谷胱甘肽的消耗，可求出酶活力。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基甲酸阴离子呈现稳定的黄色，在 412 nm 处测定其吸光度。GSH-PX计算公式为：GSH-PX=D非酶管-D酶管D标准管-D空白管×20×5酶活力单位。

1.9 统计学分析

各试验重复3次，采用SPSS 20统计软件分析数据，数据用“均数±标准差”表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行多组间差异分析。

2 结果与分析

2.1 油红O鉴定支持细胞结果

如图1所示，镜下可见支持细胞胞体呈宽大的不规则状，有粗大的突起，细胞成簇，细胞质内可见小吞噬物或小空泡，核大，呈蓝色，卵圆形或不规则形，核质均匀。细胞质中有大小不等的红色脂滴，此为支持细胞的特异性标志之一[9]。

2.2 ZEA对大鼠睾丸支持细胞细胞形态的影响

如图2所示，纯化后的细胞用ZEA培养20 h，ZEA浓度分别为0、50、 80、100、125、150 μmol/L，电镜观察细胞形态变化，可见ZEA浓度为100 μmol/L时，部分细胞开始皱缩；当ZEA浓度为150 μmol/L时，细胞形态变化明显，细胞基本皱缩，漂浮死细胞数量显著增多。

2.3 ZEA对大鼠睾丸支持细胞活力的影响

如图3所示，不同浓度ZEA培养细胞20 h，采用MTT方法检测处理细胞的活力。可以看出，随着ZEA浓度升高，细胞活力呈现降低的趋势，在150 μmol/L浓度下，细胞活力只有40%左右。0 μmol/L作为空白对照组，0.1% DMSO作为阴性对照组。

2.4 增值基因表达检测结果

支持细胞Vimentin、CCND1基因表达结果见图4与图5，原代大鼠睾丸支持细胞经不同浓度ZEA处理后Vimentin、CCND1表达差异具有统计学意义。但是Vimentin蛋白和mRNA的表达量趋势并不一致。Vimentin蛋白表达量随着ZEA浓度的提高并没有明显变化。

2.5 氧化应激指标测定结果

如图6、图7所示，大鼠睾丸支持细胞培养24 h后细胞培养液中SOD和GSH-PX检测皆有统计学差异（P<0.05）。尤其是在高浓度ZEA处理下，不管是SOD还是GSH-PX都具有增加趋势。

3 结论与讨论

ZEA在结构上与内源雌激素17p-雌二醇（E2）相似[10]，在活化ER-受体上的特征相似，能发挥雌激素样作用，ZEA与ER受体（雌激素受体）发生竞争性结合，通过激活雌激素反应元件，使雌激素受体发生二聚化，进而发生一系列的类似雌激素效应，扰乱生殖激素的正常分泌，对动物的繁殖机能造成严重危害，可导致家畜、家禽雌激素水平明显提高。研究表明，ZEA主要作用于生殖系统，对雌性动物、雄性动物都能产生危害。ZEA中毒后，雌性动物生殖系统主要表现为乳头肿大、阴唇红肿、子宫增大、假孕、不孕、胚胎骨豁发育畸形、死胎、流产以及出现持续无卵性发情期。雄性动物生殖系统主要表现为睾丸萎缩、乳头肿大、包皮水肿、精液浓度降低、质量下降等症状以及不同程度损伤的精原细胞、精母细胞[11]。

生精上皮中，能与生精细胞相接触的细胞只有睾丸支持细胞，同时它也是生精细胞的“保姆细胞”。在结构上它对生精细胞起到支架作用，促进其发育、成熟，为生精过程供给不可缺少的营养物质，同时还能协调生精细胞保证其正常进行精子发育、成熟等过程[12]。在精曲小管基底部和管腔之间的各级生精细胞按照发育、成熟的程度排列，支持细胞是提供给管腔外侧生精细胞营养的唯一来源。为了防止生精细胞和精母细胞的抗原与体内的抗体相接触，睾丸支持细胞之间形成了血睾屏障，从而阻止免疫反应产生[12]。

细胞骨架系统是真核细胞中的蛋白纤维网架体系，支持细胞具有完整和高度组织化的细胞骨架系统，对生精细胞增殖和精子生成具有重要意义。中间纤维是支持细胞骨架的重要组成部分，主要由波形蛋白（vimentin）组成[13-14]，在细胞中主要作为结构蛋白起作用[15]。在细胞凋亡过程中，Vimentin 很快被水解，其裂解是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）或是被该酶激活的一组蛋白酶所介导。睾丸支持细胞间形成紧密连接，参与形成血睪屏障，Vimentin 在支持细胞紧密连接中具有重要作用，可能参与血睪屏障功能，对维持生精上皮的完整性有重要意义，促进支持细胞和生精细胞间的物质和信息交换，精子发生并支持细胞功能的发挥。Vimentin 的降解可使支持细胞的营养和支持功能受到破坏，导致生精细胞与生精上皮分离，生殖细胞凋亡增加。本试验结果表明，随着ZEA浓度的增加，Vimentin的mRNA表达量明显减少，蛋白水平上各个浓度却没有明显变化。由此推测ZEA随着浓度的提高刺激细胞内环境的变化从而刺激Vimentin的表达，在翻译水平上，可能细胞通过别的通路和手段补偿性合成Vimentin，在高浓度ZEA的影响下，细胞活力显著降低，死细胞增多，活细胞虽然形态发生变化，可是结构依然存在，在每个毒素浓度组中蛋白浓度差不多的情况下，Vimentin最终的蛋白表达量没有明显变化，细胞还维持着相对的功能和结构，具体的机理还有待研究。

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期（G1、S、G2期）与分裂期（M期）2个阶段。1983年，Evans等首次在海洋无脊椎动物中发现一组蛋白质呈周期性出现，并调节细胞的生长，因此将其确定为细胞周期蛋白（cyclin），细胞周期蛋白D1（CCND1）是该基因编码的蛋白质，属于高度保守的周期蛋白家族，该家族成员的显著特征是贯穿细胞周期，其蛋白质丰度周期性，急剧改变[16]。周期蛋白作为CDK（周期蛋白依赖性激酶）的调节因子，CCND1调节细胞的增殖、生长、分化[17]，生命个体细胞周期的关键是G1期的启动，CCND1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，是比其他cyclins更加敏感的指标[18]。G1期是细胞在增殖过程中能接受从外界传入的增殖或抑制增殖信号的唯一时期，因此研究CCND1对细胞周期调控至关重要。目前，CCND1已被公认为是一种原癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化[19]。本研究结果表明，随着ZEA浓度的升高，CCND基因的mRNA和蛋白表达量皆显著降低，可见ZEA严重影响睾丸支持细胞的增殖，ZEA对细胞的毒性明显，细胞活性明显降低，导致大量细胞凋亡与坏死，抑制CCND1表达，导致细胞周期变长，变相导致细胞死亡加速。

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。SOD是源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。SOD几乎存在于所有生物细胞中，通过把 O-2· 转化为 H2O2，H2O2再被过氧化氢酶和氧化物酶转化为无害的水（H2O），从而达到清除细胞内氧自由基，保护细胞的目的。研究表明，对人体不断补充SOD具有抗衰老的特殊效果，可以清除超氧阴离子自由基从而保护细胞免受损伤[20-21]。本试验结果表明，随着ZEA浓度的升高，细胞培养液中SOD活力显著增高，说明ZEA可以刺激睾丸支持细胞产生氧化应激作用。可能是ZEA高浓度（150 μmol/L）下细胞破碎裂解严重，细胞内的SOD释放到培养液中，从而使其SOD活力增加，具体的机理有待进一步研究。GSH-PX是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，在机体内以硒代半胱氨酸（S）的形式发挥作用，以谷胱甘肽为还原剂分解体内的脂质过氧化物，可以防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化损[22] 。GSH-PX的作用是和SOD、过氧化氢酶（CAT）一起共同构成生物体内活性氧防御系统。机体对活性氧 O-2· 的第一道防线是SOD，它将 O-2· 转化为过氧化氢和其他氢过氧化物；第二道防线是CAT和GSH-PX，其中CAT可清除过氧体系中的H2O2，GSH-PX分布在细胞的胞液和线粒体中，可同时清除H2O2和氢过氧化物，从而有效地保护机体[23]。本研究结果表明，随着ZEA浓度的增加，细胞培养液中GSH-PX酶活力显著增加，证明ZEA能产生氧化应激作用，细胞分泌更多的GSH-PX来应对氧化应激带来的负面影响。

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