三种生境少孢节丛孢生长特性和捕食效力比较

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 三种生境少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）菌株由大理学院农学与生物科学学院微生物实验室提供。

1.1.2 培养基的配制 0.4 g/L 玉米粉琼脂培养基（CMA）：称取40 g新鲜玉米粉，加入1 000 mL去离子水，微火煮沸1 h，补足水分至1 000 mL，用纱布过滤后，取滤液10 mL，加990 mL去离子水，再加入20 g琼脂粉，经121 ℃ 30 min高压灭菌后，倾注于直径为60 mm的灭菌玻璃培养皿中备用。不同pH培养基配制方法同上，然后用1 mol/L NaOH和HCl分别调整pH至4.5～8.5，经121 ℃ 30 min高压灭菌后，倾注于直径为60 mm的灭菌玻璃培养皿中备用。

1.1.3 线虫幼虫混悬液 全齿复活线虫（Panagrellus redivivus）由农学与生物科学学院微生物实验室提供，制备成线虫幼虫混悬液（约5 000条/mL）备用。

1.2 生长率比较

1.2.1 不同温度下生长率的比较 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培养7 d的3株少孢节丛孢，在培养基边缘切取5 mm×5 mm的小块，分别接种于pH 6.0～6.2的0.4 g/L CMA上，每种菌株分为9组，每组含3个培养基，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40、45 ℃条件下培养，5 d后测算其生长率。

1.2.2 不同pH下生长率的比较 取20 ℃ 0.4 g/L CMA中培养7 d的3种菌株，在培养基边缘切取5 mm×5 mm的小块，接入制备好的CMA固体培养基中。每种菌株分为9组，分别置于pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的培养基中，每组含3个培养基，做好标记后放入30 ℃恒温箱内培养7 d。接种次日开始每天定时测量1次菌落直径，直至长满平板。然后测算其生长率。

1.2.3 有氧和无氧条件下生长率的比较 每种菌株分为2组，每组含3个培养基，所用培养基和接种方法同前。接种菌丝后，分别置于30 ℃有氧和无氧条件下培养，5 d后分别进行生长率的测定。

1.3 三种菌株捕食线虫效力比较

试验共设4个组，每组3次重复。第1、2、3组分别接种三种生境少孢节丛孢菌株，第4组为对照组（无菌株）。将各组置于各自最适培养条件下，5 d后，每个平皿内加入幼虫悬液1 mL（5 000 条/mL），在体视显微镜下检查其活力，3 d后统计线虫的死亡率。按下列公式计算出菌株捕食线虫的效力，用百分率表示。试验结果采用t检验法进行统计学分析。

R=X/（X+Y）×100%。其中，R为捕食率，X为被捕获的虫体数，Y为自由活动的虫体数。

1.4 数据处理

测定各组捕食线虫真菌的菌落直径，以平均值±标准差表示。不同处理试验结果间的差异显著性，采用新复极差法（SSR）进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生长率比较

2.1.1 不同温度下生长率比较 由表1可见，三种生境的少孢节丛孢最适生长温度为30 ℃。统计分析表明此温度条件下，真菌的生长速度与其他温度间差异显著。

2.1.2 不同pH下生长率的比较 由表2可见，三种生境捕食线虫真菌生长最适pH不同。方差分析表明，分离自淡水的捕食线虫真菌在pH 5.0、5.5时，其生长率差异显著，在pH 7.0、7.5时，真菌生长较好；分离自土壤的捕食线虫真菌在pH 4.5～5.5之间，真菌生长较好；分离自温泉的捕食线虫真菌在pH 5.5～7.0之间，真菌生长较好。

2.1.3 有氧及无氧环境下生长率比较 由表3可见，淡水和温泉生境的少孢节丛孢在有氧和无氧条件下的生长率差异不显著（P>0.05），而土壤生境少孢节丛孢在无氧条件下的生长率下降明显，生长率差异显著。

2.2 三种菌株捕食率的比较

三种生境条件下菌株捕食率统计结果（表4）表明，在淡水、温泉和土壤三种生境的少孢节丛孢其捕食效力差异不显著（P>0.05），且三者与对照组相比，捕食效力均达60%以上。

3 讨论

不同温度下的生长率比较结果显示，不同生境少孢节丛孢的最适生长温度均为30 ℃，表明同一地区不同生境条件下的少孢节丛孢对温度的适应性相同。杨晓野等[8]对少孢节丛孢CIMHI菌株生长温度范围测定为15～30 ℃，其中以20 ℃生长最好。而鄢小宁等[11]对少孢节丛孢HNQ11菌株最适生长温度的测定值为25 ℃，说明少孢节丛孢存在地区温度适应性的差异。提示在筛选生防捕食线虫真菌的时候，尽量从本地区筛选，缩短菌种的适应周期，以更好更快地发挥其捕食效力。

不同pH条件下，土壤中的少孢节丛孢在pH 4.5～5.5之间，即偏酸性的条件下生长比较好；而分离自温泉的少孢节丛孢在不同pH条件下生长速率波动较大，在pH 5.5～7.0之间的生长较好；分离自淡水的少孢节丛孢在不同pH条件下生长速率没有明显差异。从不同菌株的生长环境来看，出现这种情况的原因是由于土壤偏酸性[12]，长期生长在这种环境中的少孢节丛孢已经适应这种生存环境；温泉中的少孢节丛孢采自于大理弥渡徂莱温泉，温泉水pH为6.8，实验室测定的最适pH为6.5，两者差异不大；淡水少孢节丛孢分离自洱海，洱海水质1986～1996年偏碱性[13]，随着洱海保护效果的显现，洱海水pH已经逐渐降低，但仍然会随着季节变动[14]，导致分离自洱海的淡水捕食线虫真菌具有广泛的酸碱适应能力。

本次试验从温泉和淡水筛选到的少孢节丛孢对无氧环境的耐受力明显好于土壤生境中的少孢节丛孢菌株，出现这种现象的原因可能是由于试验所采集土样为5～15 cm土壤，其中氧含量较高所致。试验结果显示，土壤生境中的捕食线虫真菌可能不适合作为动物肠道寄生线虫生防菌株来源（动物肠道为厌氧环境）。结合不同pH下生长率的比较结果，推测水环境中的捕食线虫真菌对动物肠道环境适应能力更强。而一直以来，土壤被认为是微生物的天然种质资源库，目前已经分离到的捕食线虫真菌也绝大多数来源于土壤，因此有必要加强对水生捕食线虫真菌资源的开发和应用研究。

三种少孢节丛孢在其最适培养条件下对全齿复活线虫的捕食率测定结果分别为：温泉63.30%，土壤62.73%，淡水61.50%，差异不显著，这是否说明同一地区不同生境捕食线虫真菌的捕食能力趋同，还有待对更多不同生境同种捕食线虫真菌捕食率进行比较后方可确定。莫明和等[15]测定了少孢节丛孢对松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）和拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）的捕食率，测定结果分别为31.15%和31.12%，鄢小宁等[11]发现少孢节丛孢HNQ11菌株在25 ℃条件下对松材线虫幼虫的捕食率高达87%，表明不同地区分离到的少孢节丛孢对同种或不同线虫的捕食效率都存在较大差异，在生防菌株的选择上要充分考虑到菌株的地区差异性及线虫的种类差别。

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