四种聚酰胺—胺树状大分子制剂逆转人乳腺癌MCF—7/ADR细胞对阿霉素耐药性的研究

材料

细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7（实验室培养），人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADR（上海佛雷堡生物科技有限公司）。酶标仪（TECAN SPECTRA）（德国 Wetzlar 公司），ARX-300型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司），Bruker vector 22 型红外光谱测定仪（瑞士Bruker公司），G 3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，FA-G 4.0/DOX（自制）等。

2 方法与结果

2.1 载阿霉素树状大分子对MCF-7/ADR细胞耐药性逆转的比较

2.1.1 空白树状大分子对MCF-7/ADR细胞的细胞毒作用 取对数生长期MCF-7/ADR细胞，以10 000 cells/ 100 μL的密度分别接种于96孔培养板，37 ℃， 5% CO2条件下培养24 h，分别给予四种空白大分子100 μL/孔，使四种空白大分子在培养液中的终浓度为：1 μg/ mL、5 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL。每一浓度平行3孔，培养48 h后，每孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵箱中培养4 h后，去培养液，加DMSO 150 μL/孔，震荡10 min，在波长492 nm处测OD值，计算细胞抑制率，结果见Fig.1。

2.1.2 载药大分子对耐药细胞的细胞毒作用 取对数生长期MCF-7/ADR细胞，以10 000 cells/ 100 μL的密度分别接种于96孔培养板，37 ℃， 5% CO2条件下培养24 h，分别给予四种载药大分子和DOX溶液100 μL/孔，使药物在培养液中的终浓度为：3、9、18、24 μg/mL。每一浓度平行3孔，培养48 h后，每孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，孵箱中培养4 h后，去培养液，加DMSO 200 μL/孔，震荡10 min，波长490 nm处测OD值，计算细胞抑制率，结果见Fig.2。

图2可以看出载药大分子对MCF-7/ADR细胞抑制率的大小为：FA-G 4.0>G 4.0>PEG-G 4.0≈G 3.5>DOX。根据公式：逆转倍数（Resistance Reversion Index RRI）=DOX组IC50/制剂组IC50。计算：FA-G 4.0对MCF-7/DOX 的IC50为6.74 μg/mL，逆转倍数为5.07。

2.1.3 MCF-7/ADR细胞对载药树状大分子的摄取 细胞以1×106cells/mL种于12孔板，每孔2 mL细胞悬液。将DOX溶液和载药大分子加入细胞悬液中，使药物终浓度分别为6、12、18 μg/mL，每一浓度平行3孔，细胞孵育2小时后，去培养液，冷PBS洗3遍，200 μL胰酶消化细胞，1 mL的纯水悬浮细胞。探头超声（400 w超声8 min），10 000 rpm离心5 min，取上清液，在激发波长为497 nm，发射波长为555 nm条件下，利用荧光分光亮度计测定DOX的浓度。结果见Fig.3。

3 讨论

①载药大分子对MCF-7/ADR细胞抑制率的大小为：FA-G 4.0>G 4.0>PEG-G 4.0≈G 3.5>DOX。根据公式：逆转倍数（Resistance Reversion Index RRI）=DOX组IC50/制剂组IC50。计算：FA-G 4.0对MCF-7/DOX 的IC50为6.74 μg/mL，逆转倍数为5.07。研究表明阳离子会扰乱细胞膜，进而导致细胞凋亡，这种阳离子结构所引起细胞毒性可能是带负电的细胞膜和带正电的载体间静电相互作用的结果。表面带正电的大分子对Caco-2细胞的毒性比带负电的大分子低的多，表面带负电的大分子浓度达到2 mg/mL时也没有溶血和细胞毒性。因此G4.0相对于G3.5、PEG-G 4.0，对MCF-7/ADR细胞的细胞毒作用更强。

②目前研究认为PAMAM类高分子复合物的细胞摄取通过以下四种途径发生：一是通过胞饮作用形成被膜包围的囊泡；二是吸附性的细胞内吞作用；三是受体介导的细胞内吞作用；四是吞噬作用。所以大分子制剂进入细胞，是通过非P-gp依赖的途径，避过了P-gp的外排作用，增加了细胞内药物的含量，一定程度上克服了MDR。用FA修饰PAMAM分子，形成FA-G 4.0，其进入细胞的方式也发生了改变，是透过受体介导的细胞内吞作用，主动被细胞摄取的，因此将特异性靶向细胞的配体与药物载体结合，载体能特异性的被靶向细胞表面的受体识别并结合，避过P-gp的外排作用，增强细胞对药物的摄取。

综上所述，PAMAM是一种具有良好克服肿瘤多药耐药性应用前景的纳米载药系统。该实验对四种载药大分子（G3.5/DOX，G 4.0/DOX，PEG-G 4.0/DOX，FA-G 4.0/DOX）对逆转人乳腺癌MCF-7/ADR细胞多药耐药（MDR）的影响进行研究，使纳米载体在克服肿瘤多药耐药方面有了更大的突破。带有不同电荷及配体的PAMAM有可能在体内作用时表现出更强的多药耐药作用，其在体内的研究将是我们研究的进一步主题，可望在体内试验中达到较好的抗MDR肿瘤治疗效果。

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（收稿日期：2016-05-26）

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