根癌农杆菌介导的玉米萌动胚ＮPR1基因遗传转化
摘要：以玉米萌动胚为外植体，研究了影响根癌农杆菌介导的玉米ＮＰＲ１基因遗传转化的若干因素。结果表明，在感染液和共培养基中分别都加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４的菌液，浸染时间１２ ｈ，４０ ｍｇ／Ｌ潮霉素进行转化苗筛选，为转化的适宜条件。对转化苗进行ＰＣＲ检测，证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。
关键词：玉米；根癌农杆菌介导；遗传转化；ＮＰＲ１基因；萌动胚
中图分类号：Ｓ５１３；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2985-03
Genetic Transformation of NPR1 Gene to Germinating Embryo of Maize by Agrobacterium tumefaciens
ＱＩＮ Ｘｉｎ－ｍｉｎ，ＺＥＮＧ Ｄｅ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｈｕｉ－ｍｉｎ，ＱＩＮ Ｐｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｇｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １００ μｍｏｌ／Ｌ； ＯＤ６００ｎｍ ｏｆ ＬＢＡ４４０４ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｑｕｏｒｗａｓ ０．６； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ １２ ｈ； ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ １６ ｈ ａｔ ２６ ℃， ｕｓｅ ４０ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ． ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ； Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ
玉米是世界重要的粮食作物之一，栽培面积仅次于小麦和水稻居第三位，但产量却居世界第一。在玉米栽培过程中病害严重，如大小斑病、青枯病、病毒病、锈病等严重影响玉米的产量和品质。因此，生产上亟需优良抗病的玉米品种。转基因技术是培育抗病、高产、优质品种的有效途径之一。
ＮＰＲ１基因是植物系统获得性抗性中的一个关键基因，它可调控植物的广谱性抗性的发生，在植物系统性抗病中起着关键的作用［１］。ＮＰＲ１基因的表达可导致下游抗病基因的一系列反应，从而赋予植株对细菌病原体和真菌病原体的抗性，即使ＮＰＲ１基因过量表达也只是提高了植物的抗病性，并无其他的不良反应［２］。ＮＰＲ１基因功能是通过将克隆的野生型ＮＰＲ１基因转化到拟南芥ＮＰＲ１基因突变体中，恢复了突变体抵抗Ｐseudomonas ｓｙｒｉｎｇａｅ和Ｐhytophthora ｐａｒａｓｉｔｉｃａ的能力［３］来证实的。Ｃｈｅｒｎ等［４］在通过让水稻过量表达拟南芥ＮＰＲ１基因的实验来确定ＮＰＲ１基因在单子叶植物中所扮演的角色时，发现转基因水稻植株表现出对Ｘｏｏ（一种水稻细菌性枯叶病原体）的抗性提高，首次证明了ＮＰＲ１基因可以提高单子叶植物的抗病性。因此，ＮＰＲ１基因作为植物广谱抗病性基因日渐受到人们的关注。
利用构建的ＮＰＲ１基因表达载体，采用根癌农杆菌介导方法，以玉米成熟萌动胚为转化受体，建立了根癌农杆菌介导玉米萌动胚的遗传转化体系，获得了转基因植株。经分子检测证明外源ＮＰＲ１抗病基因已整合进转基因玉米的基因组中。
１材料与方法
１．１材料
根癌农杆菌为ＬＢＡ４４０４，所用的植物表达载体为ｐＣａＭＶＮＰＲ（带有ＮＰＲ１基因和选择性标记潮霉素磷酸转移酶基因［５］）。实验材料为玉米自交系７２３９。
１．２方法
１．２．１种子处理参照王昌涛等人的方法［６］并稍加改进。玉米种子用自来水冲洗干净，将种子浸泡在无菌水中，置于３７ ℃、４～５ ｈ，用体积分数为７０％的酒精浸泡种子１ ｍｉｎ，１ ｇ／Ｌ升汞消毒８ ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，超净台上用解剖刀在玉米胚上纵向划开１～３ ｍｍ深的口子，然后将种子浸泡在无菌水中。
１．２．２根癌农杆菌介导的转化与抗性植株的筛选
１）感染液制备。平板上挑根癌农杆菌单菌落接种于５ ｍＬ ＹＥＢ培养液中（含５０ ｍｇ／Ｌ利福平，２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素），２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养过夜。离心收集菌体，加入５０ ｍＬ新鲜ＹＥＢ液体培养基（含１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮）继续振荡培养至对数生长期。
２）浸染转化。将准备好的玉米萌动胚放入上述根癌农杆菌液中，２８ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ继续振荡１２～２４ ｈ，然后把种子放在ＭＳ固体培养基上，黑暗共培养３ ｄ。
３）抗性苗的筛选。将共培养后的玉米种子在超净台上用无菌水冲洗４次，将大部分根癌农杆菌除去，再转入带有潮霉素的筛选培养基中进行萌发筛选。
４）抗性苗的移栽。７～１０ ｄ后将根系发达、生长正常的绿苗取出，用自来水将根系上的培养基冲洗干净，移栽到通气、保水良好的基质中，用薄膜遮盖，注意保湿，防止小苗过度失水。
１．２．３转基因植株的分子检测从生长到１ ｍ高左右的抗性植株和未转化对照植株取叶片，用ＣＴＡＢ法［７］提取总ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ引物Ｐ１和Ｐ２由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Ｐ１：５′－ＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＴＴＧＡＴ
ＴＡＧＣＡＧ－３′；Ｐ２：５′－ＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＡ
ＡＧＡＧＧＣＡＡＧ－３′。
３０ μＬ ＰＣＲ反应体系：模板ＤＮＡ ３０ ｎｇ，上下游引物各０．５ μｍｏｌ，４种ｄＮＴＰ各１００ μｍｏｌ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ ３ μＬ，Ｔａｑ酶２．５ Ｕ。反应程序为９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ、５５ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ反应产物进行１％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后观察扩增结果并照相。
２结果与分析
２．１影响根癌农杆菌转化玉米萌动胚的因素
２．１．１消毒时间对种子萌发的影响采用１ ｇ／Ｌ升汞，比较了６、８、１０、１２ ｍｉｎ消毒时间对种子萌发的影响。结果发现消毒时间８ ｍｉｎ较为适宜（基本没有污染，萌发率在８５％以上），低于８ ｍｉｎ，玉米种子在随后的实验中，污染率较高。高于８ ｍｉｎ，随着消毒时间的延长，种子的萌发率会明显下降，１２ ｍｉｎ萌发率仅为６０％左右。可能是玉米种子经过３７ ℃水浴４～５ ｈ后已经开始萌发，对消毒剂比较敏感所致。
２．１．２潮霉素筛选浓度的确定实验使用的植物表达载体ｐＣａＭＶＮＰＲ的Ｔ－ＤＮＡ区含有潮霉素磷酸转移酶基因，因此用不同浓度潮霉素进行了抗性筛选实验。潮霉素浓度太低容易出现假阳性植株，过高则影响植物正常生长发育。分别选择含有０、２５、５０、７５、１００、１２５ ｍｇ／Ｌ潮霉素的ＭＳ培养基，每种培养基中接种１００粒玉米种子，进行浓度梯度实验，重复３次。从表１可以看出，当潮霉素浓度高于５０ ｍｇ／Ｌ时，基本上玉米种子都丧失了发芽能力，选择了４０ ｍｇ／Ｌ作为抗性筛选浓度，这样既可避免假阳性植株的再生，又可使抗性植株正常生长（图１）。
２．１．３浸染时间对转化率的影响分别采用４、８、１２、１６、２４ ｈ浸染玉米萌动胚，经共培养和抗性筛选后统计抗性植株数。从表２可以看出浸染时间是影响抗性植株数即转化率的一个重要因素。浸染时间过长过短都不利于萌动胚的转化，浸染１２ ｈ转化率最高（表２）。
２．１．４乙酰丁香酮对转化率的影响设计了４个处理：①不加乙酰丁香酮的对照组，②在根癌农杆菌浸染液培育中加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，③在共培养阶段加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，④在根癌农杆菌浸染液和共培养基中都加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮。实验结果表明，添加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮可以提高转化率，在菌液和共培养基中都加入乙酰丁香酮对提高转化率效果最好（表３）。
研究共转化玉米萌动胚３ ２００个，获得抗性植株６２株，移栽后成活４２株（图３），经潮霉素筛选获得的抗性苗移栽种植高达１ ｍ左右时，取其新叶提取ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，ＰＣＲ检测结果表明４２株抗性苗中１６株为阳性植株，ＰＣＲ阳性植株率约为３８．１％。现有１６株阳性植株已经结实，其Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等分子检测有待进行。
３讨论
根癌农杆菌作为自然界中存在的天然基因工程载体，具有操作方便、费用低廉、可插入片段大的外源基因、不易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点。但由于单子叶植物对根癌农杆菌不敏感，所以根癌农杆菌介导的遗传转化主要运用于双子叶植物。自１９９４年Ｈｉｅｉ利用根癌农杆菌介导的方法［８］、１９９６年Ｉｓｈｉｄａ［９］、以及１９９７年Ｃｈｅｎｇ［１０］对水稻、玉米和小麦的转化成功后，国内外学者对根癌农杆菌介导的玉米遗传转化进行了大量的研究，并且取得了明显的进展［１１－１４］。
在转化的受体系统方面，除了胚性愈伤组织外，成熟胚、茎尖、子房及花粉等都有成功的报道。各种受体系统都具有各自的特点，如胚性愈伤组织数量多，而且处于分生细胞状态，易于接受外源基因，转化率也较高。但再生植株嵌合现象严重。研究采用玉米成熟种子，使其处于萌发状态以作受体，它具有实验操作相对简单、对实验条件要求不是很高、不依赖组织培养技术、能够较快得到转基因植株、并且不受季节的限制等优点。其转化原理可能是萌动的种胚对外界因子的作用十分敏感，胚性细胞开始处于分裂状态，子叶对胚芽的包裹不再严密。此时利用高活力的根癌农杆菌浸染，将有利于对种胚生长点的转化。加上对萌动种胚的切割处理，为根癌农杆菌进入种子，与生长点细胞接触提供了通道，有利于转化的实现［６］。
利用种子萌动胚为外植体进行遗传转化，获得转基因植株的方法虽然有其优点，但与其他受体系统进行根癌农杆菌介导的转化方法一样，转化率也受到根癌农杆菌活化、浸染时间、共培养条件等多种因素的影响。因此，今后需要开展更深入的研究，以进一步提高转化率。
参考文献：
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