靶向OPN的miRNA对人肺腺癌细胞株A549顺铂敏感性的影响*
[摘要] 目的 通过miRNA介导RNAi沉默OPN表达探讨其对人肺腺癌细胞株A549顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 利用体外构建的靶向OPN的miRNA表达质粒瞬时转染A549,酶联免疫吸咐法(ELISA)检测转染后48h细胞OPN蛋白表达;转染后24、48、72、96h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别检测转染细胞和转染联合5μg/mL顺铂作用后细胞的增殖;于转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果 (1)转染后48h,OPN蛋白表达水平下调了47.34%(P<0.01)。(2)转染后24h细胞增殖开始受抑制(P<0.05),48、72、96h细胞增殖被明显抑制,细胞增殖活性差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)转染联合顺铂作用24 h细胞增殖开始受抑(P<0.05),48、72、96h细胞增殖明显受抑,细胞增殖活性转染组与未转染组及非特异性转染组差异均有统计学意义(P<0.01)。转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,当顺铂浓度为2.5、5、10、20μg/mL时,细胞增殖被明显抑制,细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 靶向OPN的miRNA抑制人肺腺癌细胞A549增殖,增强细胞对DDP的敏感性。
[关键词] 肺腺癌; OPN; miRNA; 顺铂
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-04-04
Effects of miRNA Specific for OPN on Cisplatin Sensitivity of Lung Adenocarcinoma Cell Line
TANG Rong1 JIE Kemin2 YU Xiaochun3 ZHU Weifeng2 YU Lehan2 ZHU Bailu1
1.Medical Department,Graduate School of Nanchang Universty,Nanchang 330006,China;2.Department ofBiochemistry and Molecular Biology,Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,China;3.Institute of Acupuncture and Moxibustion,China Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences,Beijing 100700,China
[Abstract]Objective To explore the drug sensitivity of lung adenocarcinoma cell line A549 to cisplatin(DDP) by miRNA specific for OPN gene. MethodsMicroRNA targeting OPN gene was transfected transiently to A549 cells by the expression plasmids which were constructed in vitro. The level of OPN protein in the A549 cells at 48 h after transfection was measured with ELISA. The cells incubated and non-incubated with 5μg/mL DDP were detected by MTT at 24,48,72 and 96 h after transfection. And the cells were cultured at different concentrations of cisplatin(DDP) for 48h,the growth inhibition rate was evaluated by MTT. Results(1)The OPN protein level was decreased by 47.34% at 48 h after transfection(P<0.01). (2)The cell proliferation started to be inhibited at 24 h after transfection(P<0.05),and was significantly inhibited at 48,72 and 96 h after transfection,with a significant difference(P<0.01). (3)After the treatment with 5μg/mL DDP,the cell proliferation started to be inhibited at 24h after transfection(P<0.05),and was significantly inhibited at 48,72 and 96h after transfection,with a significant difference in the cell proliferation activity between the transfection group and non-transfection group or non-specific transfection group(P<0.01). At 2.5,5,10 and 20μg/mL DDP,the cell proliferation was significantly inhibited,with a significant difference in the cell proliferation inhibition rate(P<0.01). ConclusionMicroRNA targeting OPN gene can effectively inhibite the cell proliferation of lung adenocarcinoma cell line and enhances the cell chemosensitization to DDP.
[Key words]Lung adenocarcinoma; OPN; miRNA; Cisplatin
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,我国肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势且发病年龄日趋年轻化[1]。骨桥蛋白(OPN)与肿瘤的生长转移及血管发生密切相关[2],作为肿瘤标志物和基因治疗的靶点日益受到关注。RNA干扰(RNAi)广泛用于抑制基因表达和研究基因功能,它由microRNA(miRNA)和小分子干扰RNA(siRNA)两种小RNA分子介导。本实验研究miRNA介导的RNAi特异沉默OPN表达对A549细胞DDP敏感性的影响,为肺癌的化疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
A549细胞株由本实验室保存,DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清为杭州四季青公司产品。重组质粒PcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR-OPN/Negative、脂质体lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;质粒小提试剂盒购自Promega公司;大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自北京全氏金公司;细胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。人OPN ELISA试剂盒购自武汉博士德生物科技公司。大观霉素(spectinomycin)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品。顺铂购自山东罗欣药业公司。
1.2 方法
1.2.1 miRNA重组质粒的扩增与纯化 -80℃冰箱取出100μL TOP10冰上融化后每100μL加入特异性干扰质粒(miRNA-OPN)和阴性对照质粒(miRNA-negative control)各2μg混匀,冰浴30min。42℃水浴90s,冰上放置1min后加入37℃温育的LB培养基100μL,37℃ 200rpm/min水平振摇1h。各取100μL转化菌涂布于LB/spectinomycin(50μg/mL)固体琼脂平板上,37℃恒温过夜,单个菌落为转化菌落。用灭菌的10μLTip头各挑取3个单克隆菌落接种到LB/ spectinomycin液体培养基中,37℃摇菌过夜,设置不加转化菌的阴性对照。次日收集细菌,按说明书快速提取小量质粒DNA,紫外分光光度计测定质粒浓度和260/280吸光度比值。
1.2.2 肺腺癌细胞株A549细胞培养与转染 对数生长期A549细胞按5×105/孔移至六孔板,细胞80%融合时进行转染。实验分为未转染组、转染组和阴性对照组。未转染组不转染miRNA,转染组转染miRNA-OPN,阴性对照组转染miRNA-negative control,每组三个复孔。按照Lipofectamine 2000说明书操作,4h后更换完全培养基继续培养。
1.2.3 ELISA法检测OPN的表达 细胞转染后48h收集细胞加250μL蛋白裂解液于4℃,30min裂解细胞。BCA法总蛋白定量。取裂解上清液按OPN说明书操作,酶标分析仪测定450nm吸光度(A)值。CurveExpert1.3软件绘制标准曲线,并计算样品中OPN含量。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性及细胞增殖抑制率 A549细胞在6孔板中转染miRNA后24h接种96孔板,细胞密度为(3×103)个/孔,每组细胞设6个复孔。培养24h后更换终浓度为5μg/mL DDP的DMEM培养液,分别在24、48、72、96h加入5 mg/mLMTT溶液20μL,继续培养4h后离心弃上清加入150 μL DMSO震荡10min,酶标分析仪测定490nm吸光度(A)值,作细胞增殖曲线。细胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)的检测为转染后24h加入不同浓度的顺铂(0、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL)继续作用48h后测定吸光度(A)值,测定方法同上。设未转染的细胞作为对照,重复实验3次取平均值。IR的计算方法是(1-A试验组/ A对照组)×100%,计算细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50)。
1.3 统计学处理
统计学处理采用统计学软件 SPSS 13.0 分析,实验数据以χ±s表示,多组间参数采用单因素方差分析,多组间参数两两比较采用q检验,不同时点的计量资料处理应采用重复资料的方差分析。
2 结果
2.1 miRNA转染后OPN蛋白抑制
ELISA结果表明miRNA-OPN能有效沉默OPN蛋白表达。转染后48h转染组,未转染组和阴性对照组细胞蛋白水平分别413.47、785.20、759.93pg/mL。转染组降为未转染组的52.66%(F=274.88,P<0.01),而阴性对照组为96.78%,与未转染组差异无显著性,见图1。
2.2 miRNA转染后细胞的增殖情况
分别在转染后24、48、72、96h加入MTT溶液测定A值。转染组,未转染组和阴性对照组在24h分别为1.08±0.07,1.23±0.09,1.21±0.09;48h为1.36±0.11,1.84±0.16,1.81±0.16;72h为1.54±0.13,2.20±0.19,2.17±0.16;96h为1.71±0.14,2.39±0.21,2.42±0.22。转染组A549生长速度明显减慢(图2),各组细胞A值比较差异均有显著性(方差分析,24h F=4.84,P<0.05, 48~96h F值分别为:26.70,31.62,22.85,P<0.01),其中转染组与未转组和阴性对照组相比有显著性差异(q检验,24h P<0.05, 48~96h P<0.01),表明靶向沉默OPN基因表达后,细胞的增殖能力明显下降。
2.3 miRNA联合顺铂作用后细胞的增殖抑制情况
转染后24h加入DDP(5μg/mL)继续作用48h,分别在24、48、72、96h加入MTT测定A值。在DDP的作用下,转染组,未转染组和阴性对照组在24h分别为1.03±0.07,1.21±0.10,1.19±0.10;48h为0.41±0.03,0.68±0.05,0.65±0.04,72h为0.29±0.01, 0.49±0.02,0.47±0.03,96h为0.18±0.01,0.33±0.02,0.32±0.02。转染组生长受抑更为明显(图3),各组细胞A值比较差异有显著性(方差分析,24h F=6.19,P<0.05,48~96h F值分别为:67.53, 83.69,129.74,P<0.01),其中转染组与未转染组和阴性对照组相比有显著性差异(q检验,24h P<0.05,48~96h P<0.01)。在转染24 h后加入不同浓度的顺铂(1.25、2.5、5、10、20μg/mL)继续作用48h,MTT法检测转染组与未转染组和阴性对照组IR分别为(26.58±0.04)%、(20.00±0.04)%、(22.66±0.05)%;(60.87±0.07)%、(41.30±0.05)%、(44.57±0.06)%;(77.72±0.06)%、(63.04±0.06)%、(64.67±0.07)%;(85.87±0.08)%、(73.91±0.07)%、(73.37±0.07)%;(92.93±0.06)%、(82.60±0.06)%、(81.52±0.05)%。与未转染组和阴性对照组比较,顺铂浓度为1.25μg/mL时,差异无统计学意义(F=2.69,P>0.05);顺铂浓度分别为2.5、5、10、20 μg/mL时,转染联合顺铂作用组细胞增殖被明显抑制,差异均有统计学意义(F值分别为:31.22,67.53, 93.78,121.48,P<0.01)。见图4。顺铂的IC50由3.20μg/mL下降为2.05μg/mL。
3 讨论
OPN是首先在骨基质中发现的一种磷酸化糖蛋白,它在组织和细胞中广泛表达。早期它被称为骨基质蛋白,T淋巴细胞活化蛋白(Eta-1)和细胞转化相关蛋白。人OPN 基因由位于4号染色体上的单拷贝基因编码,包含314个氨基酸残基,其分子量介于41~75 KD,这种分子量的差异主要是由转录后修饰的不同引起。OPN分子富含天冬氨酸和丝氨酸残基,不同种属动物都具有特异性保守序列,包括7～10个连续的Asp序列,信号肽序列,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg–Gly-Asp,RGD)序列,酪氨酸激酶磷酸化识别序列。通过这些基序,OPN与不同受体分子相互作用,介导多样的生物学功能[3]如骨的矿化、吸收和形成,细胞黏附、趋化和迁移,信号转导,免疫调节,血管发生和抑制细胞凋亡等。OPN在多种正常组织和细胞中不表达或低表达。许多类型的肿瘤如:乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胃癌、卵巢癌和黑色素瘤OPN表达都升高,且与肿瘤的进展和转移相关。此外,OPN在一些转移癌病人的全血和血浆中也有高表达[4]。Hu[5]等对479例非小细胞肺癌组织的研究表明,肿瘤组织OPN阳性表达率明显升高,且与肿瘤的大小、分期和转移相关。此外,病人血浆OPN水平明显高于健康人和肺部良性病变病人,各期肺癌病人有显著性差异。Boldrini[6]等研究表明,OPN的表达是Ⅰ期非小细胞肺癌病人恶性进展的重要指标,与病人的生存率紧密相关。与OPN生物功能密切相关的基序[7]主要有二个与整合素,三个与CD44结合的位点和一个凝血酶裂解位点。通过αvβ3整合素、FAK、PI3K、Akt、ERK和NF-κB信号通路的调节,利用不同浓度的整合素和OPN处理A549细胞后,细胞的迁移能力显著提高[8]。除此以外,OPN还含有糖基化位点、钙离子,肝素结合位点,基质金属蛋白酶酶切位点,经剪切后一些隐含于蛋白氨基酸链内部的受体结合部位被暴露出来,从而介导与多种受体的结合。有研究表明MMP-9与原发性肺癌及肺转移密切相关[9]。
RNAi广泛用于抑制基因表达和研究基因功能。它是指细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时,mRNA发生降解而导致基因表达沉默。这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)。RNAi可由miRNA和siRNA两种形式的小RNA介导。siRNA在肿瘤基因治疗方面取得了重大进展。研究表明靶向OPN的siRNA能有效沉默基因表达,使细胞生长速度减慢,侵袭和转移能力减弱,并抑制裸鼠体内肿瘤生长[10-14]。最近越来越多的研究人员通过模拟体内天然miRNA的成熟过程,利用带有polⅡ启动子的表达载体表达具有miRNA前体结构的shRNA来进行RNAi的研究,且具有更强的RNA干扰效应[15]。由慢病毒介导的miRNA干扰抑制肝癌细胞OPN蛋白表达从而使细胞生长速度明显减慢,细胞侵袭能力减弱[16]。本研究使用的干扰质粒由 Invitrogen公司构建,可在动物细胞内表达靶向调控OPN基因的miRNA。该质粒以鼠miR-154序列为骨架,且带有巨细胞病毒启动子,并优化茎环结构确保目的基因的高效敲除率。该质粒带有加强型绿色荧光蛋白(EmGFP)基因,可很方便地示踪miRNA的表达情况,并提供了EmGFP表达与miRNA基因敲除效率的强对比。本实验结果显示转染48h后,OPN蛋白水平下降了47.34 %。在转染48、72、96h后,转染组细胞生长曲线明显下移,细胞生长速度减慢。说明抑制OPN表达后,A549细胞的恶性增殖得到一定控制,为肺癌的基因治疗提供实验基础。
DDP是肺癌临床治疗的首选药物。它是细胞周期非特异性药物,可以和细胞内碱基结合,造成DNA结构和功能损伤,促进细胞凋亡。本研究结果显示,转染联合顺铂作用后细胞生长受抑制,与单纯DDP作用的细胞组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。当顺铂浓度分别为2.5、5、10、20 μg/mL时,转染联合顺铂作用后A549细胞的增殖被明显抑制,IR分别为(60.87±0.07)%、(77.72±0.06)%、(85.87±0.08)%和(92.39±0.06)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。顺铂的IC50由3.20μg/mL下降为2.05μg/mL。有研究表明特异性沉默表皮生长因子受体(EGFR)基因表达能增强A549对DDP治疗的敏感性[18]。Xie[19]等人应用高效液相色谱(HPLC)分析由慢病毒介导的靶向ATP结合盒亚家族ABCC2基因表达下调后,细胞内DDP浓度增加了2~3倍,细胞对DDP的敏感性增强[19]。这些实验结果都表明一些基因的表达与顺铂耐药紧密相关,其机制还不十分清楚,其可能的解释包括细胞对DDP解毒增强,细胞内药物浓度的改变,DNA修复能力的增强以及抑制细胞凋亡等[17]。DDP的应用有剂量限制性,最重要的是它的神经毒性导致的周围神经病变、耳鸣、听力丧失及耐药性的产生。此实验的结果表明,有效沉默OPN表达能增强A549细胞对DDP的敏感性,从而降低DDP的毒副作用和耐药性的产生,改善病人预后,为肺腺癌治疗提供实验依据,但其临床应用仍是一个需要解决的问题。
[参考文献]
[1] 葛海波. 近10年我院肺癌病例发病特征分析[J]. 临床肺科杂志,2009, 14(9):1183-1184.
[2] Irby RB,SM McCarthy,TJ. Yeatman. Osteopontin regulates multiple fu- nctions contributing to human colon cancer development and progression[J]. Clin Exp Metastasis,2004,21(6):515-523.
[3] Denhardt DT,X Guo. Osteopontin:a protein with diverse functions[J]. Faseb J,1993,7(15):1475-1482.
[4] Allan AL. Role of the integrin-binding protein osteopontin in lymphatic metastasis of breast cancer[J]. Am J Pathol,2006,169(1):233-246.
[5] Hu Z. Overexpression of osteopontin is associated with more aggressive phenotypes in human non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2005, 11(13):4646-4652.
[6] Boldrini L. Prognostic significance of osteopontin expression in early- stage non-small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer,2005,93(4):453-457.
[7] Sodek J,AP Batista Da Silva,R Zohar. Osteopontin and mucosal protection[J]. J Dent Res,2006,85(5):404-415.
[8] Fong YC. Osteopontin increases lung cancer cells migration via activation of the alphavbeta 3 integrin/FAK/Akt and NF-kappaB-dependent pathway[J]. Lung Cancer,2009,64(3):263-270.
[9] Rangaswami H,GC Kundu. Osteopontin stimulates melanoma growth and lung metastasis through NIK/MEKK1-dependent MMP-9 activation path- ways.[J]. Oncol Rep,2007,18(4):909-915.
[10] Shevde LA. Osteopontin knockdown suppresses tumorigenicity of human metastatic breast carcinoma,MDA-MB-435[J]. Clin Exp Metastasis,2006, 23(2):123-133.
[11] WaiPY. Osteopontin silencing by small interfering RNA suppresses in vitro and in vivo CT26 murine colon adenocarcinoma metastasis[J]. Car- cinogenesis,2005,26(4):741-751.
[12] Nemoto H. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell me- tastasis to bone and soft tissues[J]. J Bone Miner Res,2001,16(4):652- 659.
[13] Wu Y,DT Denhardt,SR Rittling. Osteopontin is required for full expression of the transformed phenotype by the ras oncogene[J]. Br J Can- cer,2000,83(2):156-163.
[14] Gong M. A small interfering RNA targeting osteopontin as gastric cancer therapeutics[J]. Cancer Lett,2008,272(1):148-159.
[15] Sun D. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown[J]. Biotechniques,2006,41(1):59-63.
[16] Sun BS. Lentiviral-mediated miRNA against osteopontin suppresses tumor growth and metastasis of human hepatocellular carcinoma[J]. He- patology,2008,48(6):1834-1842.
[17] Stordal B,M Davey. Understanding cisplatin resistance using cellular models[J]. IUBMB Life,2007,59(11):696-699.
[18] Zhang M. Inhibition of epidermal growth factor receptor expression by RNA interference in A549 cells[J]. Acta Pharmacol Sin,2004,25(1):61- 67.
[19] Xie SM. Lentivirus-mediated RNAi silencing targeting ABCC2 increasing the sensitivity of a human nasopharyngeal carcinoma cell line against cisplatin[J]. J Transl Med,2008,6:55.
(收稿日期:2009-11-24)