基于苯硼酸双羟基识别的竞争反应对黄芪甲苷的特异性检测研究
[摘要] 目的 创新性地提出一种可高灵敏、高选择性定量检测中药材中黄芪甲苷的新方法。 方法 将氨基苯硼酸共价吸附到多孔硅胶中，制备得到苯硼酸功能化的分子印迹材料。该印迹材料中的双羟基基团能与黄芪甲苷分子结构中的双羟基发生特异性识别。采用紫外分光光度法为检测手段，以茜素红（ARS）为光度指示剂，利用ARS与黄芪甲苷之间的双羟基竞争反应，观察加入不同浓度的黄芪甲苷后所引起可见光区吸光度的变化，达到高灵敏定量分析黄芪甲苷的目的。 结果 在510 nm处，溶液吸光度响应值的变化与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内呈现良好的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。 结论 本方法结果可信，重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量分析。
[关键词] 黄芪甲苷；茜素红；竞争反应；紫外分光光度法
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（c）-0004-04
[Abstract] Objective To establish a new strategy for the sensitive and specific determination in Chinese medicinal herbs of astragaloside Ⅳ. Methods Molecular imprinting material phenylboronic acid functionalized was prepared by the adsorption of the amino phenylboronic acid covalently to porous silica gel.Specific recognition was produced between double hydroxyl groups in molecular imprinting material phenylboronic acid functionalized and two hydroxyl groups in the molecular structure of astragaloside Ⅳ.UV spectrophotometry was adopted as the mean of detection.ARS was adopted as an indicator for the photometric.The change of visible region added to different concentrations of astragaloside Ⅳ was observed to achieve objective of the high sensitive and quantitative analysis of astragaloside Ⅳ through the double hydroxyl competitive reaction between ARS and astragaloside Ⅳ. Results Under 510 nm，the absorbance displayed a linear relationship toward astragaloside Ⅳ in the concentration range from 1.0×10-6 to 6.4×10-4 mol/L with the linear regression coefficient of 0.9929 and the detection limit of 0.3×10-6 mol/L. Conclusion This method result is reliable.It has good reproducibility，can be used for quantitative analysis in Chinese medicinal herbs of astragaloside Ⅳ.
[Key words] Astragaloside Ⅳ；Alizarin Red S；Competitive reaction；UV-vis
在中国药典中，黄芪药材及含黄芪的复方中成药一般都需要对黄芪甲苷的含量进行测定。目前测定方法多为薄层扫描法[1]，香草醛硫酸比色法[2]以及高效液相色谱法[3-4]。前两种方法操作繁琐，背景干扰多，误差较大，且后者空白吸收值高，受时间因素干扰较大；在高效液相色谱法测定中，黄芪甲苷分子结构中只含有一种活性基团——羟基，所以很难将其与黄芪中其他含有相同活性基团，如葡萄糖、蔗糖、芒柄花黄素等碳水化合物分离，因此，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新方法。
分子印迹技术因具有预定性、识别性、实用性三大特性，在中药活性成分的分离和纯化中发挥重要作用[5]。如张玉奎课题组将非瑟酮分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，成功地对非瑟酮及其相似物槲皮素进行分离[6]。由于硼酸结构中的邻二羟基基团能选择性识别多糖分子，可与包括糖在内的1，2-或1，3-二羟基化合物以较高的结合效率可逆结合，从而形成稳定的酯类化合物[7-8]，因而近年来被广泛应用于多糖化合物的检测。
基于上述原理，本文创新性地提出一种可高灵敏、高选择性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新方法。笔者首先将氨基苯硼酸共价结合到多孔的硅胶结构中，并以黄芪甲苷为模板分子，制备了苯硼酸功能化的黄芪甲苷分子印迹材料；同时利用黄芪甲苷与茜素红（ARS）和氨基苯硼酸之间的竞争反应，建立能精确识别黄芪甲苷并高灵敏检出的新方法。
1 材料与方法
1.1 试剂
实验中所有试剂均为分析纯。氨基苯硼酸、ARS、黄芪甲苷均购自上海Sigma试剂公司。PBS溶液由126.7 mmol/L氯化钠、2.7 mmol/L氯化钾、8.72 mmol/L磷酸氢二钠、1.41 mmol/L磷酸二氢钠配制而成，用浓盐酸调节至不同pH。
1.2 仪器
紫外分光光度计（UV-2450，岛津，日本），超声波清洗器（KQ218，昆山，江苏），离心机（TG20，湖南凯达）。
1.3 实验方法
1.3.1 实验原理 本实验的检测机制如图1所示。游离的ARS在510 nm处会产生明显的紫外吸收峰。实验中，将制备的苯硼酸功能化的介孔硅印迹材料浸于ARS溶液中，此时ARS中的邻二醇结构能与苯硼酸发生共价结合作用，从而连接到印迹材料的表面，溶液中游离的ARS浓度降低，吸光值下降；当黄芪甲苷定量加入到上述混合液之后，由于黄芪甲苷具备与ARS相似的邻二醇结构，两者会发生竞争反应，从而与表面ARS竞争结合苯硼酸，相应地表现为溶液中ARS浓度和吸光度增加。利用黄芪甲苷加入前后所引起吸光度的变化，达到间接检测黄芪甲苷的目的。
1.3.2 氨基苯硼酸功能化硅胶印迹材料的制备 该复合材料由华东师范大学施国跃课题组友情提供。该印迹材料以黄芪甲苷为模板分子，可选择性识别黄芪甲苷。
1.3.3 印迹材料与ARS的结合 分别称取1.25 mg印迹材料、1.15 mg ARS和0.24 mg黄芪甲苷，并分别溶解于1、2、5 ml的0.1 mol/L PBS（pH=7.4）溶液中，使三者的最终浓度分别为1.25、0.575、0.048 mg/ml，置于超声清洗器中超声分散10 min。
1.3.4 UV-vis检测 分别移取50 μl 0.575 mg/ml的ARS和100 μl 1.25 mg/ml印迹材料至同一EP管中，超声分散10 min后，室温下继续放置5 h，保证两者能完全反应，检测溶液的紫外吸收。之后，向上述溶液中继续加入50 μl 0.048 mg/ml黄芪甲苷标准溶液，重复以上测定步骤。
2 结果
3 讨论
黄芪素有“补药之长”之称，具有益气固表、利尿托毒等功效，在临床上常用来治疗非特异性免疫功能低下、乙型肝炎和心血管系统疾病[9]。黄芪甲苷作为中药黄芪的指标性成分应用于黄芪药材的质量监控[10-11]，目前其测定方法操作繁琐，背景干扰多，误差较大，且特异性差[12-13]。因此，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新方法。本文创新性地提出了一种可高灵敏、高选择性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新方法。以苯硼酸双羟基识别竞争反应为原理，通过制备氨基苯硼酸功能化的黄芪甲苷分子印迹材料，以达到对黄芪甲苷进行精确的定量。
利用紫外-可见分光光度法证明黄芪甲苷和ARS能与印迹材料表面的硼酸基团发生竞争结合作用。图2结果所示，ARS和黄芪甲苷都能与硼酸发生共价结合作用。该混合体系中存在两个共价结合作用平衡，第一个平衡存在于硼酸与ARS之间，第二个平衡存在于硼酸与黄芪甲苷之间。因此，黄芪甲苷的加入会破坏硼酸与ARS之间的作用平衡，从而导致紫外吸收峰强度的改变。在证实该原理的基础上，又对竞争反应的pH进行优化，并确定反应介质的最佳pH为9.0。在上述最佳实验条件下，可知在510 nm处，溶液吸光度响应值的变化与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内呈良好的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。该检测方法结果可信、操作简捷、重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量分析。
[参考文献]
[1] 鲁静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法测定[J].中成药，1992，14（6）：34-35.
[2] 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定[J].中药通报，1986，11（9）：38-39.
[3] 王改香，朱智甲，林苗，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定黄芪中的黄芪甲苷[J].分析试验室，2009，28（7）：108-111.
[4] Qi LW，Yu QT，Li P，et al.Quality evaluation of Radix Astragali through a simultaneous determination of six major active isoflavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].J Chromatogr A，2006，1134（1-2）：162-169.
[5] 周媛媛，孟子晖，董美伶.分子印迹技术在天然产物有效成分分离纯化中的应用[J].色谱，2009，27（3）：359-363.
[6] 李礼，胡树国，何锡文，等.应用分子印迹固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮[J].高等学校化学学报，2006，27（4）：608-611.
[7] Tong A，Yamauchi A，Hayashita T，et al.Boronic acid fluorophore/beta-cyclodextrin complex sensors for selective sugar recognition in water[J].Anal Chem，2001，73（7）：1530-1536.
[8] Salzmann CG，Llewellyn SA，Tobias G，et al.The role of carboxylated carbonaceous fragments in the functionalization and spectroscopy of a single-walled carbon-nanotube material[J].Adv Mater，2007，19（6）：883-887.
[9] Yan MM，Liu W，Fu YJ，et al.Optimization of the microwave-assisted extraction process for four main astragalosides in Radix Astragali[J].Food Chem，2010，119（4）：1663-1670.
[10] Ma XQ，Duan JA，Zhu DY，et al.Chemical comparison of Astragali Radix（Huangqi）from different ragions of China[J].Nat Med，2000，54：213-218.
[11] 徐希科，李慧梁，柳润辉，等.HPLC-ELSD法测定黄芪药材中黄芪甲苷[J].中草药，2005，36（11）：1720-1722.
[12] 林绪芳，张礼菊，邓晓辉.黄芪甲苷定量检测方法比较[J].中国药房，2007，18（21）：1670-1671.
[13] 欧燕春华.黄芪甲苷含量测定几种常用方法的比较[J].中国现代药物应用，2009，3（15）：139-141.
（收稿日期：2014-08-29 本文编辑：李亚聪）