根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究
摘要：以小麦栽培品种郑麦９０２３成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌菌株ＧＶ３１０１将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。考查了ＭＳ培养基中ＮＨ４ＮＯ３浓度对组织培养的影响，以及高渗处理对转化过程的作用。结果显示，２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度可明显提高愈伤组织再生率，高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。经抗性筛选和ＰＣＲ鉴定，共得到了４株转基因小麦植株，平均转化效率为 ０．１８％。
关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；转化
中图分类号：Ｓ５１２．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3637-03
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｅａｔ Ｍａｔｕｒｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｉｓｓｕｅｓ
ＬＩ Ｙａｎ－ｃｈｕａｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Sciences ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ by Agrobacteroum strain GV3101 ｕｓｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｍａｉ ９０２３ ａｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＨ４ＮＯ３ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ 2.5 times ｏｆ ＮＨ４ＮＯ３ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃould ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ callus． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ identification， ４ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ of ０．１８％．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ； Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
１９９７年，Ｃｈｅｎｇ等［１］首次用农杆菌介导法获得可育的转基因小麦植株。几年后，夏光敏等［２］、叶兴国等［３］也分别报道利用农杆菌法获得了转基因小麦植株。随后越来越多的研究机构对农杆菌介导的小麦遗传转化方法作了更加细致与深入的研究［４－８］，使得该方法的转化效率不断提高。但上述报道大多用小麦幼胚及其诱导产生的愈伤组织作为转化受体，虽然小麦幼胚再生能力强，但取材在时间和空间上受到很大限制，适宜转化的生理状态难以掌握，转化周期也比较长。相比幼胚，成熟胚取材方便，生理状态一致，不受生长季节限制，是组织培养和遗传转化理想的外植体。本研究以小麦成熟胚诱导的愈伤组织为转化受体，在已有研究基础上［９－１１］选择根癌农杆菌介导小麦遗传转化的几个重要影响因素，进行比较与优化，旨在为进一步建立和优化根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系奠定基础。
１材料与方法
１．１试验材料
小麦品种郑麦９０２３以及质粒 ｐＴＲＡｋｃ－ＢＡＲ－ＵＴ－Ｒｓ－Ｄ２和根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１均由华中农业大学麦类分子生物学实验室提供。
１．２试验方法
１．２．１培养基诱导培养基含ＭＳ基本培养基［１２］、肌醇１００ ｍｇ／Ｌ、天门冬氨酸 １３４ ｍｇ／Ｌ、脯氨酸１１５ ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ １．９５ ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ ２ ｍｇ／Ｌ、麦芽糖４０ ｇ／Ｌ、植物凝胶５ ｇ／Ｌ；同时设计了３种ＮＨ４ＮＯ３浓度修饰的诱导培养基（表１）。浸染培养基、分化筛选培养基、生根筛选培养基及生根壮苗培养基等参照文献配制［９，１３］。
１．２．２种子表面消毒及预处理选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的小麦成熟种子，用７０％的乙醇浸泡５ ｍｉｎ，无菌水冲洗２～３次，再经０．１％ ＨｇＣｌ２浸泡１５ ｍｉｎ，无菌水冲洗６～８次后，置于含８ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ溶液的无菌三角瓶中３３ ℃浸泡５ ｈ。预处理后的种子用７０％的乙醇浸泡１ ｍｉｎ，无菌水冲洗２～３次，再经０．１％的ＨｇＣl２浸泡５ ｍｉｎ，无菌水冲洗３～４次。
１．２．３愈伤组织的诱导用左手拿镊子夹住已浸泡过的成熟种子无胚的一端，右手拿手术刀将成熟胚纵切成两半后，将胚剥出，切面向下放置于诱导培养基上，（２５±１）℃暗培养１４ ｄ。
１．２．４农杆菌接种菌液的准备挑取含目的质粒的农杆菌ＧＶ３１０１单菌落于１０ ｍＬ含２５ ｍｇ／Ｌ kan、１００ ｍｇ／Ｌ rｉｆ和１００ ｍｇ／Ｌ cａｂ的ＹＥＢ培养基中，２８ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ暗培养过夜。吸取１ ｍＬ培养物转入５０ ｍＬ含２５ ｍｇ／Ｌ kan、１００ ｍｇ／Ｌ rｉｆ和１００ ｍｇ／Ｌ cａｂ的ＹＥＢ培养基中，２８ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ继续暗培养至ＯＤ６００nm＝０．８～１．０。将菌液转至无菌离心管中，
４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；菌体沉淀用液体浸染培养基洗涤一次后，用液体浸染培养基重悬，使重悬菌液ＯＤ６００nm＝１．０。重悬菌液中加入终浓度为２００ μｍｏｌ／Ｌ的ＡＳ、０．０１５％的Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７，用于侵染小麦外植体。
１．２．５农杆菌介导转化转化前先将愈伤组织放入６孔培养板中室温下黑暗条件高渗处理２～４ ｈ（对照不处理），然后吸出高渗培养液用重悬好的菌液室温下浸染２０ ｍｉｎ，再用液体共培养培养基洗２ 次（每次５ ｍｉｎ），取出愈伤组织，在无菌滤纸上吸去多余菌液，放置于含４００ μＬ液体共培养培养基的无菌培养皿中内置灭菌Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１滤纸上，２１ ℃黑暗共培养４８ ｈ。
１．２．６转化受体的筛选共培养后的转化受体转至恢复培养基，恢复培养１～２周再转入再生培养基，培养２～４周。待芽苗长至３ ｃｍ左右，将其转入生根筛选培养基，最后将得到的抗性苗进行壮苗培养。
１．２．７ＰＣＲ检测基因组ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法。设计ＰＣＲ引物检测目的基因是否转入成功，引物序列为ＵｂｉＰ５：５′－ＣＡＴＣＴＣＴＧＴＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧ－３′；ＵｂｉＰ６：５′－ＣＧＧＴＡＧＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＣ－３′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，目标片段大小为４９５ ｂｐ。反应体系为：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ １．５ μＬ，１．２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ 引物各０．５ μＬ，５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶０．５ μＬ，模板 ＤＮＡ ２０～５０ ｎｇ，补超纯水至总体积２５ μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９５ ℃预变性４ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５８ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３６个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。ＰＣＲ产物采用１．２％琼脂糖进行凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相。
２结果与分析
２．１ＮＨ４ＮＯ３浓度对农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化的影响
培养基中加入不同浓度的ＮＨ４ＮＯ３，对小麦成熟胚组织的再生有明显的影响（表２）。含２．５倍ＮＨ４ＮＯ３时再生率和抗性苗数明显高于其他浓度。但随着ＮＨ４ＮＯ３浓度的继续增加，愈伤组织的诱导变得困难且生长缓慢，可能是由于ＮＨ４ＮＯ３浓度过高会导致植物细胞内外渗透压的变化，对其生长产生不利影响。
２．２高渗处理对郑麦９０２３成熟胚再生的影响
愈伤组织的高渗处理能提高郑麦９０２３的再生率（图１），其机理可能是高渗处理造成愈伤组织的渗透胁迫，从而启动内在调节系统，提高愈伤组织活力。另外，高渗处理后细胞内外形成压力差，细胞发生质壁分离，液泡变小，此时再与农杆菌混合，能有效地促使农杆菌吸附在细胞表面，并借助此压差更易转入到愈伤组织细胞内，从而提高转化效率。
２．３抗性植株的再生和转基因植株的获得
预培养１４ ｄ的郑麦９０２３成熟胚愈伤组织（图2Ｂ）经农杆菌感染后转到恢复培养基上，以促进侵染细胞的生长。再转入再生培养基，培养２～４周。待芽苗长至３ ｃｍ左右（图2Ｃ），将其转入生根筛选培养基（图2Ｄ），期间大部分幼苗不能生根，最终变黄枯死（图2Ｅ），最后将得到的４株抗性苗进行壮苗培养，春化后移入温室（图2Ｆ）。
２．４转基因植株的ＰＣＲ检测结果
提取４株转化植株的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，结果如图３。从图３可以看出在３、４、５、６泳道中都有大小约５００ ｂｐ的特异性片断，而阴性对照没有扩增产物，证明在转化植株中有目的基因的插入，平均转化效率为０．１８％。
３讨论
以小麦成熟胚为外植体进行组织培养的报道已不少，农杆菌介导的小麦遗传转化也有很多研究，但以成熟胚为转化受体的报道很少。本研究根据已有文献的研究基础和华中农业大学麦类分子生物学实验室的实际情况，以Ｙｕ等［９］的组织培养再生程序为基础，采用成熟胚纵切的培养方式，并参考了已报道的转化程序［１０－１４］，采用预培养１４ ｄ经高渗处理后的愈伤组织为受体，用含２００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ、０．０１５％ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７的浸染培养液培养３ ｈ，干燥共培养３ ｄ，经筛选鉴定得到了４株转基因小麦植株，初步建立了可用于小麦成熟胚的根癌农杆菌转化系统。
同源重组被认为是目的基因整合进植物基因组的主要方式之一，ＮＨ４ＮＯ３作为一种大量元素能提高同源重组的频率，所以在较高浓度的ＮＨ４ＮＯ３条件下外植体可能具有更高的转基因整合效率。Ｂｏｙｋｏ等［１５］对农杆菌介导的烟草转化研究发现通过增加培养基中ＮＨ４ＮＯ３的浓度，转化效率比对照提高了３倍。小麦的基因枪转化研究中也发现高浓度的ＮＨ４ＮＯ３不仅可以使转化效率增加７倍，而且胚性愈伤组织的发生效率也增加了２倍［１６］。本实验的结果也证明２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３浓度对农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化过程中愈伤组织的再生率、抗性苗数目的提高均有帮助。
在侵染过程中，运用高渗处理被认为可以提高转化效率，这可能是由于高渗处理后细胞内外形成压力差，细胞发生质壁分离，液泡变小，此时再与农杆菌混合，能有效地促使农杆菌吸附在细胞表面，并借助此压差更易转入到愈伤组织细胞内［１７］。另外本研究发现高渗处理可以提高抗性愈伤的再生率，可能是由于成熟胚诱导的愈伤组织分化能力比较差，经高渗处理后，产生胁迫应答，使部分愈伤组织重呈胚性状态，从而明显地提高抗性愈伤的比率。以上研究结果对于进一步开展以小麦成熟胚为外植体源的遗传转化研究具有参考意义。
参考文献：
［１］ ＣＨＥＮＧ Ｍ， ＦＲＹ Ｊ Ｅ， ＰＡＮＧ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９７，１１５（３）：９７１-９８０．
［２］ 夏光敏，李忠谊． 根癌农杆菌介导的小麦转基因植株再生［Ｊ］． 植物生理学报，１９９９，２５（１）：２２－２８．
［３］ 叶兴国，ＳＡＴＯ Ｓ，徐惠君，等． 小麦农杆菌介导转基因植株的稳定获得和检测［Ｊ］． 中国农业科学，２００１，３４（５）：４６９－４７４．
［４］ 王翠亭，卫志明． 根癌农杆菌介导小麦幼胚遗传转化的影响因素［Ｊ］． 植物生理与分子生物学学报，２００３，２９（６）：５２１－５２９．
［５］ 王永勤，肖兴国，张爱民． 农杆菌介导的小麦遗传转化的几个影响因素的研究［Ｊ］． 遗传学报，２００２，２９（３）：２６０-２６５．
［６］ ＷＵ Ｈ，ＳＰＡＲＫＳ Ｃ，ＡＭＯＡＨ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Cｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００３，２１（７）：６５９－６６８．
［７］ ＫＨＡＮＮＡ Ｈ，ＤＡＧＧＡＲＤ Ｇ． Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｕｐｅｒｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ａ ｐｏｌｙａｍｉｎｅ－ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２００３，２１（５）：４２９－４３６．
［８］ ＨＥ Ｙ， ＪＯＮＥＳ Ｈ Ｄ， ＣＨＥＮ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ Ｌ． Ｖａｒ． Ｄｕｒｕｍ ｃｖ ｓｔｅｗａｒｔ） ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ６１（６）： １５６７．
［９］ ＹＵ Ｙ， ＷＡＮＧ Ｊ， ＺＨＵ Ｍ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ-ｂａｓｅｄ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｌｉｔｅ ｗｈｅａｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２００８， １２７（３）： ２４９－２５５．
［１０］ ＤＩＮＧ Ｌ， ＬＩ Ｓ， ＧＡＯ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ｅｌｉｔｅ ｗｈｅａｔ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００９，３６（１）：２９－３６．
［１１］ ＷＡＮＧ Ｙ Ｌ， ＸＵ Ｍ Ｘ， ＹＩＮ Ｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． ＣＥＲＥＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，２００９，３７（１）：１－１２．
［１２］ ＭＵＲＡＳＨＩＧＥ Ｔ， ＳＫＯＯＧ Ｆ． Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｇｒｏｗｔ ｈａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１５：４７３－４９７
［１３］ ＷＵ Ｈ， ＤＯＨＥＲＴＹ Ａ， ＪＯＮＥＳ Ｈ Ｄ． Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｄ ａｎｄ ｄｕｒｕｍ ｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９， ４７８（２）：９３－１０３．
［１４］ ＧＯＥＴＺ Ｈ， ＣＨＲＩＳＴＩＮＥ Ｋ， ＳＹＬＷＩＡ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐ ｐｌａｎｔｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｂａｒｌｅｙ， ｗｈｅａｔ， ｔｒｉｔｉｃａｌｅ， ａｎｄ ｍａｉｚｅ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，２００９：１-９.
［１５］ ＢＯＹＫＯ Ａ， ＭＡＴＳＵＯＫＡ Ａ， ＫＯＶＡＬＣＨＵＫ Ｉ． Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００９， ２８（５）：７３７－７５７．
［１６］ ＧＲＥＥＲ Ｍ Ｓ， ＫＯＶＡＬＣＨＵＫ Ｉ，ＥＵＤＥＳ Ｆ． Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｄｉｒｅｃｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ［Ｊ］． Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２６（１－２）： ４４－５２．
［１７］ 任艳，黄玉杰，张新建，等． 高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响［Ｊ］． 食用菌学报，２０１０，１７（１）：６－１３．