柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用
摘 要 建立柑橘黄龙病（HLB）可视化环介导等温扩增（LAMP）检测方法，为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理，针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，并在反应前的体系中加入1 ∶ 10的钙黄绿素（calcein）和氯化锰（MnCl2）混合液作为荧光显色剂，建立可视化LAMP检测技术，同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性，反应体系中除了HLB具有特异性的扩增，产生黄绿色荧光扩增产物，其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL，而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL，与定量PCR灵敏度相当，而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测，结果2种技术的检出率均为76.7%，符合率达到100%。
关键词 柑橘黄龙病菌；钙黄绿素；环介导等温扩增（LAMP）；可视化
中图分类号 S436.66 文献标识码 A
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生产上的毁灭性病害，该病害是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，能够侵染包括柑橘属（Citrus spp.）、枳属（Poncirus trifoliata）、金柑属（Fortunella spp.）和九里香（Murraya paniculata）等多种芸香科植物[1]。柑橘感染黄龙病菌后，病害迅速蔓延，3～13年果园内95%的植株将被感染而发病[2]；发病植株叶片大量脱落，树势减弱、产量降低、果质变差[3]；一般，柑橘树的经济寿命可达几十年，甚至上百年，但是感染黄龙病后，柑橘树势衰退，经济寿命大大缩减，大约仅有十年左右[4]。中国有柑橘栽培的19个省、区已有11个受到严重的黄龙病害威胁[5]。对于黄龙病菌的培养，最早于20个世纪80年代就有报道[6-7]，但并未得到认可；Davis等[8]和Sechler等[9]分别通过共培养和纯培养获得病原菌，但是获得的病原菌均无法完成继代培养。对于柑橘黄龙病的防治主要采用抗生素，如四环素等，但经过3～4年后，黄龙病症状出现反复[1]。Zhang等[10-11]报道1.0 g/L盘尼西林和100 mg/L链霉素混合液对黄龙病菌有很好的抑制作用，但作用效果持续时间并未得到验证。黄龙病在防治上主要采用防治传播媒介、砍除病树、使用无病苗等方法实现对病害的控制。
柑橘黄龙病的检测主要包括传统检测和分子生物学检测。传统检测方法不仅耗时、耗力，且检测结果可靠性低；分子生物学方法主要包括常规PCR、巢式PCR（nest-PCR）和定量PCR（real-time PCR）等，虽然能够较快速、准确地检测出病原，但需要特定的试验仪器设备且检测成本较高，不适宜基层检验检疫部门田间大规模应用，使田间病情无法得到及时、准确的检测和有效的控制，严重阻碍了国内柑橘产业的发展。为加强柑橘无病苗木检测及田间黄龙病发生动态监测，确保福建省柑橘产业的健康发展，需建立一种经济、简便、快速、准确、有效的柑橘黄龙病菌检测方法。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是由Notomi等[12]于2000年开发的一种高效的核酸恒温扩增方法。LAMP反应在等温条件下，短时间内实现产物的大量扩增，具有很高的特异性和灵敏度，且操作步骤简便，检测结果可由肉眼判断，因此更适合于基层检验检疫部门开展工作。LAMP技术已经被广泛的应用在细菌、真菌、病毒、寄生虫检测中，已成功建立沙门氏菌[13-14]、金黄色葡萄球菌[15-17]、鸭瘟病毒[18]、口蹄疫病毒[19-20]、恶性疟原虫[21-22]等LAMP检测体系。目前，对LAMP检测结果的分析方法主要包括肉眼观察反应液是否产生焦磷酸镁盐沉淀[23]、琼脂糖凝胶电泳[24-25]及加入SYBR Green I是否发荧光来判断[26-27]。LAMP反应因其灵敏度高、产物量大的特点，使反应过程极易受到产物污染而出现假阳性现象。采用肉眼观察焦磷酸镁盐沉淀方法在焦磷酸镁盐沉淀浓度较低时容易误判，而其余2种分析方法虽然结果准确、方便，但是都需要进行开盖操作，这无疑会增加假阳性的概率。因此，笔者通过反应前在体系中加入适量的钙黄绿素和氯化锰，利用1 ∶ 10的钙黄绿素和氯化锰混合液能很好的发挥荧光显色指示作用[28-29]，从而实现检测结果的可视化，同时还可有效避免反应后由于开盖操作而产生的假阳性，建立了一种柑橘黄龙病菌的可视化快速恒温扩增检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验时间、地点 本研究田间试验于2012年在福州新店埔党福建省农业科学院果树研究所试验基地进行，室内试验于2013年在福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心实验室进行。
1.1.2 试验材料 柑橘溃疡病菌、大肠杆菌、根癌农杆菌、亚洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌等DNA样品由福建省农业科学院果树研究所提供；马铃薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放线菌等DNA样品由福建省农业科学院植物保护研究所提供。Bst DNA Polymerase Large Fragment、10×Thermopol缓冲液购自NEB公司；钙黄绿素、MgSO4、MnCl2、Betaine购自Omega公司；TWeen-20购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2×SYBR Premix Ex TaqTM、rTaq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA Ladder Marker均购自TaKaRa公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GeneBank中登录的“Ca. L. asiaticus”基因组的16s r-DNA基因序列（GeneBank： KF510119.1），利用PrimerExplorer V4在线软件（http：//primerexplorer.jp/e/）设计外引物（F3和B3）和内引物（FIP和BIP）；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列信息详见表1。
1.2.2 LAMP反应体系和反应条件优化 参考Xu等[30]和Bobby等[31]及LAMP反应试剂盒推荐的体系，对反应体系（CG-FIP/BIP、CG-F3/B3、Mg2+、dNTPs、Betaine的终浓度等）和反应条件（反应温度和时间）进行优化。CG-FIP/BIP终浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol/L；CG-F3/B3终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L；Mg2+终浓度分别为2、4、6、8、10 mmol/L；dNTPs终浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L；Betaine终浓度分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L；反应温度分别为57、59、61、63、65 ℃；反应时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。每个因子设置3个重复，以确定最佳反应体系及反应条件。
1.2.3 LAMP特异性检测 以柑橘黄龙病菌总DNA及柑橘溃疡病菌、大肠杆菌、根癌农杆菌、亚洲梨火疫病菌、葡萄炭疽病菌、马铃薯晚疫病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌、放线菌等参试菌株的DNA为模板，以健康叶片总DNA为阴性对照、ddH2O为空白对照，采用优化后的反应体系及条件进行LAMP反应，检测可视化LAMP方法的特异性。反应结果分别通过肉眼观察和1%琼脂凝胶电泳进行分析。
1.2.4 LAMP灵敏度检测
（1）基因组DNA检测灵敏度。参照试剂盒的方法，提取染病柑橘中脉总DNA，用超微量分光光度计（NanoDrop）测定总DNA浓度，取1 μL DNA按照10倍进行梯度稀释（100～10-9），为了避免稀释过程中出现误差，每个梯度分别重复3次，再将每个梯度的3个重复混合，取1 μL作为模板，进行LAMP灵敏度检测。
（2）LAMP与普通PCR、定量PCR灵敏度比较。利用CG03F/CG05R引物扩增含有目的基因的DNA片段[32]，回收纯化PCR产物，并连接到pMDTM18-T载体上，构建CG-pMD18-T重组质粒，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆子进行扩大培养，提取质粒DNA，用超微量分光光度计（NanoDrop）测定质粒DNA浓度，并进行10倍梯度稀释（100～10-9），方法同上。定量PCR和普通PCR的引物均为LAMP的外引物（F3/B3）。常规PCR反应体系：2×Mix 12.5 μL、CG-F3/B3 1 μL、模板1 μL，加ddH2O补足至25 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 35 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，扩增32个循环，72 ℃ 7 min。反应产物1%琼脂糖凝胶电泳分析。定量PCR反应体系：2×SYBR Premix ExTMⅡ 12.5 μL、5 μmol/L CG-F3/B3引物各 1 μL、模板DNA 1 μL，加ddH2O补足到25 μL。反应程序为：95 ℃ 35 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 35 s，扩增42个循环，58 ℃同步采集荧光；溶解曲线为65 ℃开始，每隔5 s升高0.5 ℃，连续升高60次至95 ℃结束。以上试验均设置3次重复。
1.2.5 样品检测 从福建漳州、南平、福州等地采集柑橘黄龙病疑似病例的芦柑叶片30份，洗净后置于4 ℃冰箱短期保存；剪取芦柑叶片中脉0.5 g，剪碎后用液氮磨成粉末，用CTAB法提取芦柑叶中脉总DNA：细粉加入CTAB提取液，混匀后65 ℃水浴1 h，12 000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积氛 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）提纯，无水乙醇沉淀，将沉淀风干后溶于30 μL TE（含RnaseA 50 μg/mL）中，沉淀溶解后置于-20 ℃保存、备用。
分别采用可视化LAMP和定量PCR检测，比较2种检测结果的检出率和2个检测结果间的符合率，以验证LAMP技术的实际应用效果。
2 结果与分析
2.1 LAMP反应体系和反应条件优化
2.1.2 反应条件优化
（2）反应时间。如图2-c、d所示，当反应时间为30 min时，可以观察到反应液颜色由橙色变为绿色，且琼脂糖凝胶电泳检测可见明显的梯度条带；当反应时间为70 min时，反应液颜色变化非常明显，且电泳条带也非常的清晰，为了提高试验效率，故确定反应时间为70 min。
2.2 LAMP特异性检测
2.3 LAMP灵敏度检测
3 讨论与结论
LAMP是一种在恒温条件下，高效、特异、快速的扩增靶标序列的核酸扩增技术。本研究在柑橘黄龙病菌16S r-DNA基因序列的6个位点设计4条引物。通过对反应体系和反应条件进行优化，建立了可视化LAMP检测方法。该方法对柑橘黄龙病菌总DNA及其他参试菌株DNA进行特异性检测，结果表明该可视化LAMP具有良好的特异性。对柑橘黄龙病总DNA和质粒DNA的最低检测限分别为1.51×10-3 ng/μL和2.12×10-6 ng/μL，与定量PCR灵敏度相当，而比常规PCR灵敏度高1 000倍。采用该方法对田间样品进行实测，检测结果和real-time PCR检测结果完全一致。
荧光显色剂的应用使LAMP检测结果可视化得以实现。目前，在荧光显色剂应用的研究中多数采用SYBR Green I[33-34]，该方法需在反应结束后打开盖子，加入SYBR Green I才能发挥显色指示作用，从而判定检测结果。黄丽等[34]在柑橘黄龙病LAMP检测中，利用SYBR Green I指示作用实现了LAMP检测结果的可视化。但是，开盖添加SYBR Green I时容易产生气溶胶，而引起扩增产物污染实验室，导致假阳性出现。孔德英等[35]在柑橘黄龙病LAMP检测中使用浊度仪实时监测LAMP反应结果，但该方法在实际操作中要使用价格昂贵的浊度仪，不利于实验设备较落后的实验室的科研人员开展工作。笔者利用calcein与Mn2+结合而不发荧光，随着反应的进行，产生了大量更易与Mn2+结合的焦磷酸根离子，从而释放calcein，游离的calcein可自发荧光，且Mg2+存在的环境中荧光效果得到加强[28，36]的原理，使用calcein+MnCl2混合液替代SYBR Green I进行结果显色指示，无需开盖，直接通过肉眼观察颜色变化即可判定检测阴（橙色）阳（绿色）性结果，实现了检测结果的可视化，同时有效地避免了因开盖引起反应产物污染而出现的假阳性现象。该方法在柑橘黄龙病可视化LAMP检测中的应用尚属首次，为柑橘黄龙病的检测工作提供了有力的技术支持。
虽然本研究在柑橘黄龙病可视化LAMP检测中获得了比较的好结果，但是在反应体系和反应条件优化等方面还存在一些不足。应采用更加科学合理的方法（正交试验）等进行进一步优化。由于在对可视化LAMP结果的评价中无法对其反应结果进行量化，因此要采用正交试验设计比较困难。在今后的研究中重点要解决如何将可视化LAMP的结果进行量化，从而更加明确反应体系中各组分对反应结果的影响。
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责任编辑：沈德发