氧化硅介孔材料在基质辅助激光解析飞行时间质谱分析有机小分子中的应用
摘要研究了表面修饰的无机有机复合型介孔材料SBA15NA（1，8Naphthalimide）作为基质在MALDITOFMS分析中的应用。采用1，8萘酰亚胺修饰SBA15，1，8萘二甲酸酐先与3三甲氧基硅基1丙胺反应，得到的产物再修饰到SBA15，得到SBA15NA，应用修饰后的介孔材料SBA15NA为基质获得了具有背景离子干扰少、离子化效率高、更高的峰值强度等优点的谱图。甲醇作为溶剂，分析物和基质的浓度比例为1∶10，采用以样品和基质等体积混合均匀点样方法，对低糖类、氨基酸类、植物激素生物代谢物和药物等不同结构的小分子化合物（分子量小于500）进行了MALDITOFMS分析。在此优化的条件下得到了低检出限1×10
1引言
代谢物组学是在生命科学研究中发展起来的一种新兴技术，它重点研究生物体系的内源性和外源性代谢物浓度及其动态变化，主要研究对象是分子量小于1000的小分子化合物。目前，常用的主要研究手段是NMR＼[1＼]， GCMS＼[2＼]， LCNMR＼[3＼]， LCNMRMS＼[4＼]和数据处理等技术。
基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术是近年发展起来的质谱离子化新技术。该技术成功解决了非挥发性和热不稳定性的生物大分子难以电离问题＼[5，6＼]，因此广泛应用于基因组学、蛋白质组学、转录组学等生命科学领域。然而，由于基质自身产生的离子严重干扰小分子目标物在低分子量区域（<400 Da）的分析，所以该技术不能广泛用于低分子量化合物的分析。为了克服这些问题，人们在基质的选择和改进方面进行了大量研究。1988年，Tanaka等[6]首次将纳米材料作为基质引入到MALDITOFMS 分析中成功应用30 nm无机钴纳米颗粒和甘油混合分析了蛋白质溶菌酶。随后，以多孔硅＼[7＼]、碳纳米管＼[8＼]、硅纳米粒子＼[9＼]、金纳米粒子＼[10＼]等作为基质，广泛应用在MALDITOFMS分析技术中。多种修饰的多孔硅粉和硅胶颗粒用于MALDITOFMS分析小分子化合物＼[11～14＼]。Li等＼[15＼]成功将喹啉修饰到介孔材料SBA15上，将其作为MALDITOFMS的基质应用到分析低分子量的糖类化合物和天然蜂蜜中。
本研究以1，8萘二甲酰亚胺固定化介孔材料，应用表面修饰的无机有机复合型介孔材料SBA15NA作为辅助基质，进行了低糖、氨基酸以及药物小分子化合物的MALDITOFMS分析。与常用的有机基质（如DHB，CHCA）比较，介孔材料能够有效克服使用有机基质分析样品时带来的基质信号干扰问题，可以成功实现小分子化合物的高通量快速分析。
2实验部分
2.1试剂
SBA15介孔材料（赵东元院士先进材料实验室提供）； 1，8萘二甲酸酐和3三甲氧基硅基1丙胺（北京Aldrich公司）。2，5二羟基苯甲酸（DHB）、α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、肌红蛋白、糖类、植物激素、药物、胞嘧啶、肌肽和5氮胞苷（Sigma公司）。氨基酸生化标准试剂（上海康达氨基酸厂）。所有溶剂均为色谱纯（Sigma公司）； 超纯水由Millipore纯水系统制备。尿样采自志愿者，采集后于
Symbolm@@ 80 ℃保存。
2.2实验方法
介孔材料的修饰：在干燥的50 mL两口瓶中加入100 mg， 0.5 mmol/L 1，8萘二甲酸酐， 20 mL无水乙醇，升温至回流，待酸酐全部溶解后，搅拌下滴加等当量的3三甲氧基硅基1丙胺，N2保护下回流反应3 h，TLC追踪反应进展。反应结束后，将反应液转移至100 mL单口瓶中，减压除去无水乙醇，得微黄色固体M1。向100 mL单口瓶中加入30 mL精制甲苯，待固体全部溶解后，再向其中加入1 g有序硅介孔材料SBA15，N2保护下回流反应2 h，反应结束后，冷却至室温，减压抽滤，滤饼用甲苯、四氢呋喃、丙酮、氯仿进行多次洗涤，除去未反应物，所得滤饼在N2保护下干燥，得微黄色固体SBA15NA，见图解1。
[TS（][HT5”SS]图解1SBA15NA 合成路线
分析条件：MALDITOFMS：采用了AXIMACFRTM plus基质辅助激光电离飞行时间质量分析系统（日本岛津公司），采用N2激光源，发射波长为337 nm。正离子反射模式，加速电压20 kV，扫描范围为m/z 50～2000 Da， 每张质谱图由总激光发射脉冲次数为50的质谱图平均累计产生。在数据采集前，用马心肌肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作为标准物，校正仪器的绝对准确度至0.1 Da。样品与基质溶液采用混合点样方法（1 μL点样）。PRESTIGE21红外光谱仪（KBr压片法）， UV2550分光光度计（岛津公司）。
3结果与讨论
3.1介孔材料的修饰
Symbolm@@ 1与羰基相连的CN伸缩振动）附近也有吸收， SBA15则没有这些吸收，表明1，8萘酰亚胺成功接到SBA15上。另外，紫外光谱（图1B）， SBA15NA在350 nm（1，8 萘酰亚胺的特征吸收）附近有吸收带， SBA15 则没有，表明1，8萘酰亚胺成功接到SBA15上。SBA15NA的吸收与传统的基质CHCA吸收在相似位置，这是本合成方法的一个重要方面，因为它使新的基质对标准的MALDITOF质谱仪的激光光源有很强的吸收。3.2低糖分析
MALDITOFMS在糖类的分析中具有良好的应用前景＼[15＼]。本实验采用有机基质DHB和新型介孔材料分别作为基质进行了MALDITOFMS分析。从图2可见，3种糖类的碱金属离子加合离子峰在不同基质下都可检测到，它们分别是D葡萄糖（m/z 203＼[M+Na＼]+、219＼[M+K＼]+），D蔗糖（m/z 365＼[M+Na＼]+， 381＼[M+K＼]+），D木糖（m/z 173＼[M+Na＼]+， 189＼[M+K＼]+）。图2a出现了DHB的一些明显的基质干扰峰（m/z 177＼[M+Na＼]+， 193 ＼[M+K＼]+），图2b和2c杂峰少。这说明在此基质作用下，样品分子及基质分子相当稳定，在离子化过程中几乎不发生碎裂。这是因为当1，8萘酰亚胺官能团修饰到SBA15的表面后，不易汽化到气相中变成离子，从而能有效去除基质在低分子量区域的干扰。与图2b相比，图2c中3种糖类质谱峰的信号强度增强，这可能是由于修饰到介孔二氧化硅材料上的1，8萘酰亚胺能够吸收激光照射，所以SBA15NA比SBA15有更强的光吸收，而且可与样品溶液充分混匀，所以它更容易促进分析物的解吸/电离。
3.3氨基酸的分析
氨基酸的分子量一般小于300 Da，传统基质本身在此分子量区域产生大量的基质干扰使得氨基酸的MALDITOFMS分析变得复杂。本实验分别以有机基质CHCA和新型介孔材料分别为基质，进行氨基酸分析。从氨基酸在不同基质下的MALDITOFMS分析结果（图3）可知，两种氨基酸都能检测到，它们分别是缬氨酸（Val）
氨基酸在小分子量区域的检测。与图3结果一致，利用基质SBA15NA得到的质谱图比使用其它基质（CHCA）得到的信号强度都大数倍，信噪比都改善很多。由此推测，新合成的复合型介孔材料能有效去除基质在低分子量区域的干扰，重现性好，而且有机基团的引入使得4c图中的氨基酸的质谱峰的信号强度增强，具有较宽可测质量范围，在小分子快速检测和蛋白质组学领域有很大的应用空间。3.4其它小分子的分析
上述实验表明，基质SBA15和SBA15NA成功用于糖类和氨基酸类的检测，达到了去除基质在低分子量区域的干扰的效果。为了考察基质SBA15NA在其它小分子化合物中的应用，本研究选取药物小分子：普萘洛尔盐酸盐（Propranolol hydrochloride）、维拉帕米盐酸盐（Verapamil hydrochloride）、阿替洛尔（Atenolol）；植物激素脱落酸（Abscisic acid）、玉米素（Zeatin）作为模型分子进行研究，模型分子都可以检测到（表1）。从表1可见，与基质SBA15相比，基质SBA15NA对于分析物具有更好的离子化作用。因此，MALDITOFMS测定小分子样品时，基质的寻找和开发显得更为重要。