一氧化氮供体SNP对水稻根中由硒引起的脂质过氧化的调节作用
摘要：研究以0.2和20 μmol/L Na2SeO3及一氧化氮供体硝普钠（SNP）处理对水稻根中根系活力和硫代巴比妥酸反应产物含量，愈创木酚过氧化酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性等生理生化指标的影响。结果表明，1 μmol/L SNP处理显著提高0.2 μmol/L Na2SeO3处理下水稻根系活力，SNP通过促进CAT酶活性，缓解了膜脂过氧化；在20 μmol/L Na2SeO3处理下，1 μmol/L SNP明显促进SOD酶活性，但显著降低APX酶活性，显著降低根系活力。NO对水稻根中Se引起的抗氧化活性变化具有调节作用，根系活力可以作为评价抗氧化活性的重要参考。
关键词：水稻；硒；一氧化氮；抗氧化作用
中图分类号：Q945 文献标志码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5133-04
Effects of Exogenous Nitric Oxide Donor SNP on Lipid Peroxidation Caused by Selenium in Roots of Rice Seedlings
XIAO Qiang
（Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province / Hubei Institutes for Nationalities， Enshi 445000， Hubei， China）
Abstract： In this study， we reported some antagonist effects of exogenous nitric oxide on oxidative stress of rice induced by selenium. The root activity， the contents of TBARS and the activities of GPX， SOD， CAT and APX in roots of rice seedlings treated with varied concentrations of selenium and 1 μmol/L SNP were investigated. The results showed that the root activity increased by treatment of SNP in 0.2 μmol/L Na2SeO3 group. SNP alleviated significantly the lipid peroxidation in rice seedlings via increasing CAT activities in rice root. In 20 μmol/L Na2SeO3 treated rice seedlings， SNP aggravated significantly the root activity loss via promoting SOD activities and repressing APX activity. Taken together， results suggested that NO regulates antioxidative activity caused by selenium in roots of rice seedlings. Root activity can be used as reference index of evaluating antioxidative activity.
Key words： rice； selenium； nitric oxide； antioxidation
一氧化氮（Nitric oxide，NO）是植物中一种重要的信号分子，在调节植物生长发育，促进植物细胞衰亡等方面发挥着重要作用[1]，进一步研究表明NO在植物中的某些功能与它对活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代谢水平的调节密切相关，如NO可作用于烟草中含血红素铁的过氧化氢酶（Catalase，CAT）和含非血红素铁的抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX），参与对活性氧代谢的调节[2]。NO还可能通过提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性和降低膜脂过氧化作用来减缓缺水造成的离体水稻叶片的衰老[3]。NO也可以通过促进镉在根部积累并上调铁吸收相关基因表达增强拟南芥对镉毒的抗性[4]。我们的研究结果也表明0.01 mmol/L硝普钠（Sodium nitroprusside，SNP）可显著缓解镧引起的氧化胁迫[5]。
硒（Se）是环境中一个十分重要的生命元素，它与硫元素在化学特性上有很多相似之处，硒在动物和人体内最主要的生物学功能是作为谷胱甘肽过氧化物酶系（GSH-Px）的组成成分，参与体内氧化还原反应，清除自由基，减少对生物膜等造成的机体过氧化损伤。在植物中，Se可以显著增强小麦、玉米、大豆和油菜体内抗氧化能力，维持植株正常生长[6]。土壤环境因子、养分供应状况等对植物Se吸收、转运、富集以及代谢的影响已有较多报道。迄今，对于信号分子尤其是NO是否参与了Se诱导的抗氧化活性调节过程仍不为人知，我们在此报道外源SNP对由亚硒酸钠（Na2SeO3）诱导的水稻根中抗氧化活性变化的调节作用。
1 材料与方法
1.1 材料培养与处理
水稻品种为金优58，种子经0.1% HgCl2消毒，水洗，25℃浸种、催芽。1周后用木村B溶液水培，温度26 ℃，光照400 μmol/（m2·s），光/暗时间为12 h/12 h，至两叶一心期在培养液中加入Se和SNP同时进行处理。Na2SeO3和SNP均购自上海生工生物工程有限公司（BBI原装）。设3个Se处理，分别为0、0.2和20 μmol/L Na2SeO3；每种Se处理再设两种SNP浓度，分别为0和1 μmol/L，共6个处理组。每个处理设3个重复，每天更换处理液1次，在处理3 d后测定表明各处理间根系活力差异显著，因此取相应时段幼根进行相关生理生化指标测定。
1.2 测定项目与方法
1.2.1 根系活力 采用TTC法进行测定[7]。
1.2.2 硫代巴比妥酸反应产物（TBAPS）含量测定 取幼根0.7 g，加入4 mL 10% 三氯乙酸（TCA）研至匀浆，离心，取上清液，参照Dhindsa等[8]的方法测定。
1.2.3 酶液制备 取0.5 g新鲜水稻幼根于冰浴研钵中，加少许石英砂和1 mL预冷的酶提取液（用50 mmol/L、pH 7.8的磷酸缓冲液配制，内含1%聚乙烯吡咯烷酮，5 mmol/L的乙二胺四乙酸），测定APX时，提取液含5 mmol/L ASA，迅速匀浆，4 ℃，20 000 g离心20 min，取上清液备用。
1.2.4 蛋白质含量测定 采用Bradford法[9]测定，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作为蛋白质标准。
1.2.5 SOD活性测定 参照Beauchamp等[10]所建立的方法测定，SOD活性分析前过Sephadex G-25柱以避免SNP对活性测定的干扰，以抑制氮蓝四唑（NBT）在光照下被还原50%的酶量为一个酶活性单位（U）。
1.2.6 GPX活性测定 参照Ruan等[11]的方法测定，以460 nm吸光值每分钟上升0.1为一个酶活性单位（U）。
1.2.7 CAT活性测定 参照Chance等[12]的方法测定，以240 nm吸光值每分钟减小0.1为一个酶活性单位（U）。
1.2.8 APX活性测定 参照Parida等[13]的方法测定，以280 nm吸光值每分钟减小0.1为一个酶活性单位（U）。
1.3 数据分析
用SPSS软件进行数据方差分析，以Origin软件绘制图表。
2 结果与分析
2.1 根系活力的改变
由图1可知，与对照组相比，0.2和20 μmol/L Na2SeO3处理对水稻根系活力没有显著影响；20 μmol/L Na2SeO3处理组显著高于0.2 μmol/L Na2SeO3处理组；在无Se情况下，1 μmol/L SNP可以显著提高水稻根系活力（P<0.05）。外加1 μmol/L SNP显著提高0.2 μmol/L Na2SeO3处理下水稻根系活力；但在20 μmol/L Na2SeO3处理的水稻幼根中，外加1 μmol/L SNP则显著降低根系活力。
2.2 TBARS含量的改变
如图2所示，和根系活力相似，0.2和20 μmol/L Na2SeO3处理对水稻幼根TBARS含量没有显著影响；两种浓度Na2SeO3处理之间差异不显著。在无Se情况下，1 μmol/L SNP对TBARS含量亦无显著影响。外加1 μmol/L SNP对0.2和20 μmol/L Na2SeO3处理组亦无显著影响。
2.3 抗氧化酶活性的改变
作为植物抗氧化系统的一个重要组分，抗氧化酶在消除ROS方面具重要作用。SOD，GPX，CAT及APX的活性在各种胁迫下经常发生改变。与对照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3处理对幼根中SOD的活性无显著影响；20 μmol/L Na2SeO3处理则显著下降（P<0.05）；单独1 μmol/L SNP处理对幼根中SOD活性亦无显著影响。外加1 μmol/L SNP可以显著缓解20 μmol/L Na2SeO3处理引起的SOD活性下降（图3A）。与SOD活性相比，不同处理条件下，GPX活性表现出不同的特征。各处理组间GPX活性差异不显著（图3B）。CAT活性变化如图3C所示，与水稻幼根中SOD活性变化类似，0.2 μmol/L Na2SeO3处理对幼根中CAT的活性无显著影响；20 μmol /L Na2SeO3处理则显著下降（P<0.05）；单独1 μmol/L SNP处理显著提高幼根中CAT活性。外加1 μmol/L SNP显著促进0.2 μmol/L Na2SeO3处理组活性（P<0.05），但对20 μmol/L Na2SeO3处理组CAT活性无显著影响。如图3D所示，与对照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3处理显著促进幼根中APX活性（P<0.05），20 μmol/L Na2SeO3处理引起幼根中APX活性显著下降（P<0.05）；单独SNP处理对幼根APX活性无显著影响。外加1 μmol/L SNP对0.2 μmol/L Na2SeO3处理组幼根中APX活性亦无影响，但却显著降低20 μmol/L Na2SeO3处理组幼根中APX（P<0.05）。
3 讨论
SNP普遍作为NO的外源供体，Delledonne等[14]发现0.5 mmol/L SNP大约释放2.0 μmol/L NO。预备实验以0、0.2、0.5、1、2、5、10、50 μmol/L SNP处理水稻根系，结果表明浓度达到1 μmol/L时，根系长度显著高于对照组，而浓度超过5 μmol/L 时，根系生长与对照不存在差异，据此确定了本试验SNP浓度；同时研究了0、0.2、2、10以及20 μmol/L Na2SeO3对叶绿素含量的影响，结果显示在2 μmol/L以下差异不显著，而10 μmol/L和20 μmol/L均显著降低叶绿素含量，据此确定了本试验硒浓度。
从本研究中可以看出，SNP和Se对根系活力存在协同效应：SNP协同低浓度Se可以提高根系活力，而SNP与高浓度Se共同处理则显著降低根系活力。这与我们关于SNP和Se对水稻幼苗叶绿素含量的影响具有相似规律（见另文）。其可能原因在于：在厌氧情况下，植物根系线粒体是NO合成的重要场所[15]，NO通过降低低浓度Se引起的线粒体电子传递速率上升[16]而发挥抗氧化功能，维持了根系还原能力；另一方面，NO也加剧了高浓度硒引起的线粒体电子传递速率下降，进一步抑制了根系呼吸。
已有报道，低浓度硒可以显著提高植物中抗氧化酶SOD和GPX转录水平，进而激活了植物抗氧化保护机制[17，18]。本研究与此不同，0.2 μmol/L Na2SeO3处理对SOD活性没有影响，而20 μmol/L Na2SeO3处理则引起SOD活性显著下降；GPX活性则不受Se处理浓度影响。这种差异可能源于所采用的不同植物材料和不同器官（根和叶片）。0.2 μmol/L Na2SeO3处理显著提高了水稻根中APX酶活性，1 μmol/L SNP处理也可以提高水稻根中CAT酶活性，两者都可以有效清除ROS，维持根系活力。Beligni等[19]认为，作为一种抗氧化剂，NO可以抵消许多由ROS介导的细胞毒害作用。在本研究中，总体来看，0.2 μmol/L Na2SeO3处理下，外加1 μmol/L SNP对于水稻幼根中CAT酶活性有显著提高效应，与此同时，根系活力显著升高；表明根系脱氢酶活性显著升高。20 μmol/L Na2SeO3处理下，根中SOD活性显著下降，与此同时CAT和APX活性也是下降的，有利于维持对ROS清除的相对平衡，因此，根系活力与对照相比差异不显著。但在外加1 μmol/L SNP情况下，SOD活性上升到对照组水平，而APX酶活性水平进一步下降，由此导致ROS产生与清除不平衡，ROS累积加剧了对根系的损伤，引起根系活力显著下降。上述研究结果与NO缓解高浓度稀土元素镧引起的氧化性损伤以及镉毒性的研究结果存在较大差异[5，20]。其可能原因在于镧和镉是植物非必需金属元素，其毒性与金属离子引起的过氧化有关[20]，NO可以直接拮抗其导致的过氧化效应；而Se属于非金属元素，主要通过类似植物必需元素硫方式参与细胞生化反应[21]；NO对其生理生化效应调节的详细机制有待于进一步研究。
已有研究证实高等植物根部线粒体电子传递链是NO合成的主要场所[15]。在本研究中，1 μmol/L SNP促进了0.2 μmol/L Na2SeO3处理下水稻幼根中CAT酶活性，提高了根系活力；外加1 μmol/L SNP促进20 μmol/L Na2SeO3处理组水稻幼根SOD活性显著上升，而APX酶活性水平进一步下降，由此导致ROS产生与清除失衡，引起根系活力显著下降。上述主要研究结果表明NO对于水稻根中Se引起的脂质过氧化存在明显调节作用，由于高等植物根部线粒体可以利用亚硝酸盐合成NO[15]，通过合理施用氮肥以调节水稻根部内源NO合成，对于有效改善高硒地区水稻生长具有重要实践意义。
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