农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立
摘要：以玉米（Zea mays L.）HiII的幼胚为外植体，β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）为报告基因，通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化，以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。结果表明，幼胚大小为1.0～1.5 mm，农杆菌菌液的OD600 nm为0.5，40 ℃热处理3 min，侵染8 min，共培养3 d和恢复培养4 d，100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂，双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料，表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。
关键词：农杆菌介导转化法;玉米（Zea mays L.）;幼胚;遗传转化
中图分类号：S513;Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）12-2743-04
Establishing Genetic Transformation System of Maize Immature Embryos Mediated by Agrobacterium tumefaciens
SUN Chuan-bo，GUO Jia，YUAN Ying
（Agro-Biotechnology Research Institute， Jilin Academy of Agriculture Sciences， Changchun 130033，China）
Abstract： In order to establish genetic transformation system of maize immature embryos mediated by Agrobacterium tumefaciens， factors including size of explants， concentration of Agrobacterium tumefaciens， temperature of thermal pretreatment， infection time， cultivation and recovery time， antibiotics， screening agent affecting genetic transformation system were optimized using immature embryos of HiII as explants and GUS as reporter gene. The results showed that the size of the embryos was 1.0 to 1.5 mm in length. The OD600 nm of Agrobacterium was adjusted to 0.5 before inoculation. Pretreatment was 3 min at 40 ℃. Infection time was 8 min. It was co-cultivated 3 days and rested 4 days. 100 mg/L carbenicillin was used to eliminate Agrobacterium and bialaphos was used as selective agent. Transgenic plants were obtained by the optimized system， which was a highly and reliable system.
Key words： Agrobacterium tumefaciens-mediated method; maize（Zea mays L.）; immature embryos; genetic transformation
玉米（Zea mays L.）是重要的粮食作物和工业原料作物之一，在国民经济生产中具有重要战略地位。利用基因工程技术手段创制性状优异的转基因玉米新种质具有重要的理论和现实意义，为玉米育种技术开辟了新途径。自1988年Rhodes等[1]首次获得转基因玉米完整植株，1996年Ishida等[2]初步建立农杆菌遗传转化体系以来，玉米遗传转化研究得到了迅速发展，目前已有多种转基因玉米商业化生产。玉米遗传转化的方法主要有农杆菌介导转化法、基因枪转化法、合子转化法和花粉管通道法等，农杆菌介导转化法和基因枪转化法最为常用[3-5]，农杆菌介导转化法因具有外源基因整合位点稳定、转化机理清楚、转基因后代拷贝数低、遗传稳定性好、实验操作方便、成本低等优点而更受青睐[6]。研究表明基因型和外植体是影响玉米遗传转化率的关键因素[7]，目前成功的基因型材料多为玉米A188和HiII，而幼胚因再生能力明显高于其他部位而被广泛应用。建立稳定高效的遗传转化体系是研究转基因玉米的关键，根据不同的转化方法和受体已建立了多种体系，并获得了抗除草剂、抗虫、抗病、抗寒和抗旱等多种转基因种质材料[7-15]。
本研究以具有高再生能力的玉米HiII幼胚为外植体，探索外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素对遗传转化的影响，通过β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）瞬时表达率分析优化各因素，集合各优化因子建立高效稳定的农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系，为转基因玉米产业化发展提供高效稳定的转化平台。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 玉米HiII。
1.1.2 植物表达载体和菌株 植物表达载体为pCAMBIA3301，菌株为农杆菌EHA105。
1.1.3 培养基及成分 侵染培养基（IM）：1/2 MS盐+1/2 MS维生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+200 μmol/L AS+36 g/L蔗糖+68 g/L葡萄糖，pH 5.2;继代培养基（M）：MS盐+MS维生素+100 mg/L肌醇+500 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L L-脯氨酸+200 mg/L L-天门冬酰胺+1.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂，pH 6.0;共培养培养基（CM）：继代培养基+100 μmol/L AS+850 mg/L AgNO3，pH 6.0;恢复培养基1（RM1）：继代培养基+0.5 g/L MES+100 mg/L Car，pH 6.0;恢复培养基2（RM2）：继代培养基+0.5 g/L MES+250 mg/L Cef，pH 6.0;选择培养基1（SM1）：继代培养基+1.5 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;选择培养基2（SM2）：继代培养基+3.0 mg/L Bialaphos或Glufosinate+100 mg/L Car，pH 6.0;分化培养基（FM）：继代培养基+0.5 mg/L KT，pH 6.0; 生根培养基（GM）：继代培养基+0.5 mg/L IBA+5 g/L活性炭;YEB培养基：10 g/L酵母提取物+10 g/L蛋白胨+5 g/L NaCl，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 外植体制备 取授粉9～12 d左右的雌穗，剥去苞叶，将顶端切去1 cm左右后浸泡在70%乙醇中，15 min后取出并用无菌水洗净，在超净工作台上剥取幼胚，幼胚大小0.5～2.0 mm，置于含有1.5 mL IM的EP管中备用，每管中含有50多个大小相同的幼胚。
1.2.2 外植体遗传转化
1）工程菌制备。将保存于-80 ℃冰箱中的农杆菌于YEB固体培养基上划线培养，培养至长出直径约 1 mm大小的单菌落，经分子验证后重新在YEB固体培养基上划线培养，19 ℃培养3 d后收集菌体，用IM悬浮，加入乙酰丁香酮（AS）至终浓度为200 μmol/L，并制备成不同浓度的工程菌备用。
2）外植体侵染。制备的幼胚，一部分经过不同温度水浴热处理3 min后立刻冰浴1 min再进行转化，一部分直接用于转化。工程菌液的OD600 nm分别为0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0，侵染时间分别为2、5、8、11、14 min，侵染结束后，弃掉菌液，将幼胚置于灭菌的滤纸上，吸去多余菌液，转移到CM中，整个过程不能伤害幼胚。
1.2.3 共培养及恢复培养 转化后的幼胚置于CM中，21 ℃暗培养1～5 d。共培养后的幼胚，一部分转移到RM1中，一部分转移到RM2中，经过4 d的恢复培养，其他的不经过恢复培养，直接转移到SM中进行筛选。
1.2.4 抗性愈伤组织的筛选 恢复培养后的幼胚转移到SM1中，经过14 d的筛选后转移到SM2中，经过3轮筛选，每轮筛选时间为14 d，最后得到抗性愈伤组织。
1.2.5 转化植株的获得及检测
1）转化植株的获得。将抗性愈伤组织转移到FM和GM中，经过分化和生根培养后获得转化植株。
2）GUS瞬时表达检测。幼胚用磷酸缓冲液清洗后置于GUS染色液中，37 ℃温浴24 h，在显微镜下统计带有蓝斑的幼胚，并计算GUS瞬时表达率。GUS瞬时表达率=（有蓝斑幼胚/侵染幼胚）×100%。
3）转化植株的分子检测。提取转基因玉米基因组DNA[8]，进行Bar和目的基因的PCR检测。取1 cm左右PCR阳性的转基因植株叶片，按照试纸条检测方法对转基因植株进行检测。
2 结果与分析
2.1 外植体大小对遗传转化的影响
幼胚的大小直接影响遗传转化效果，试验中将幼胚大小分为0.5～1.0 mm、1.0～1.5 mm、1.5～2.0 mm 3类，用OD600 nm为0.5的菌液侵染8 min，21 ℃共培养3 d后进行GUS检测，结果如图1所示。由图1可知，幼胚大小为1.0～1.5 mm的GUS瞬时表达率最高，为12.08%，明显高于其他幼胚的GUS瞬时表达率，因此选择1.0～1.5 mm的幼胚作为受体材料。
2.2 农杆菌浓度（OD600 nm）对遗传转化的影响
用OD600 nm分别为0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0的菌液侵染幼胚大小为1.0～1.5 mm的外植体8 min，21 ℃共培养3 d后进行GUS检测，结果如图2所示。由图2可知，当OD600 nm为0.5和0.6时，GUS瞬时表达率较高，二者相差很小，但高浓度的农杆菌对幼胚伤害较大，并影响后期的愈伤诱导，因此后续试验选择农杆菌菌液OD600 nm为0.5。
2.3 热预处理温度对遗传转化的影响
在幼胚侵染前，将浸泡在IM中的幼胚采用35、40、45、50 ℃水浴热处理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm为0.5的菌液侵染幼胚大小为1.0～1.5 mm的外植体8 min，21 ℃共培养3 d后进行GUS检测，结果如图3所示。由图3可以看出，随着热处理温度升高，GUS瞬时表达率先升高后降低，40 ℃时最高，50 ℃时较低，可能是温度太高对幼胚造成了巨大伤害，有些幼胚甚至死亡，因此后续试验选择40 ℃热处理3 min。
2.4 侵染时间对遗传转化的影响
以40 ℃水浴热处理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm为0.5的菌液分别侵染幼胚大小为1.0～1.5 mm的外植体2、5、8、11、14 min，21 ℃共培养3 d后进行GUS检测，结果如图4所示。由图4可以看出，侵染时间对转化体系的影响也很大，侵染8 min的GUS瞬时表达率最高，侵染5 min和11 min两者的GUS瞬时表达率差别不大，但是后期的幼胚培养中发现，侵染11 min比侵染5 min的农杆菌污染严重，而且幼胚生长状态不好，且不容易分化，因此后续试验选择侵染时间为8 min。
2.5 共培养时间和恢复培养对遗传转化的影响
以40 ℃水浴热处理3 min后，立刻冰浴1 min，然后用OD600 nm为0.5的菌液侵染幼胚大小为1.0～1.5 mm的外植体8 min，21 ℃共培养1～5 d后直接进行GUS检测或再恢复培养4 d后进行GUS检测，考察共培养时间和恢复培养对遗传转化的影响，结果如图5所示。由图5可以看出，共培养3 d的GUS瞬时表达率最高，恢复培养4 d比无恢复培养的瞬时表达率明显升高，因此选择共培养3 d和恢复培养4 d。
2.6 抗生素和筛选剂对遗传转化的影响
抗生素在抑制农杆菌的同时也影响转化率，在恢复培养基中分别加入100 mg/L Car或250 mg/L Cef来抑制农杆菌的生长，结果表明，羧苄青霉素（Car）作为抑菌剂明显好于噻孢霉素（Cef），同时对于幼胚生长的影响也小于Cef。
在选择培养基中分别使用双丙氨膦（Bialaphos）和草胺膦（Glufosinate）为筛选剂，经双丙氨膦筛选的后代假阳性率低于10%，而草胺膦筛选的后代假阳性率高达70%，因此选择双丙氨膦作为筛选剂。
2.7 高效遗传转化体系的建立
集合各优化因子，即幼胚大小为1.0～1.5 mm，农杆菌菌液的OD600 nm为0.5，40 ℃热处理3 min，侵染8 min，共培养3 d和恢复培养4 d，100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂，双丙氨膦作为筛选剂，建立的遗传转化体系3次试验的GUS瞬时表达率平均为32.26%，明显高于未优化体系（CK）的11.90%（表1）。
2.8 转基因植株分子检测
对获得的转基因植株初步采用PCR检测方法，经Bar基因PCR检测，1～9号转基因材料全部为阳性;经目的基因PCR检测，1～8号转基因植株为阳性（图6）。通过Bar试纸条进行蛋白质水平检测，3、6、7、8、9号转基因植株为阳性，有非常清晰的检测线出现（图7）。
3 结论
在玉米遗传转化研究中，外植体的类型有很多种，幼胚因易转化、再生能力强而被广泛应用，幼胚的大小直接影响遗传转化率，本研究证明幼胚大小在1.0～1.5 mm时，GUS瞬时表达率最高，为12.08%，该结果和国内外很多研究结果相符[13-16]。高浓度菌液、长时间侵染对幼胚的伤害较大，在不影响遗传转化率的情况下，尽量选择低浓度、短时间侵染，本研究证明菌液OD600 nm为0.5、侵染8 min时，GUS瞬时表达率最高。对比已建立的以胚性愈伤组织为外植体的玉米遗传转化体系[17]，菌液OD600 nm要小0.1，侵染时间要减少7 min。在遗传转化过程中共培养3 d后采取4 d的恢复培养，让转化材料尽早适应筛选环境，可明显提高GUS瞬时表达率。本研究对幼胚材料进行40 ℃热预处理3 min，GUS瞬时表达率提高1倍多，与Hiei等[18]的研究结果相比略微不同，可能是受体材料基因型不同造成的，热处理还需要更广泛的试验来证明。抑菌剂不仅影响幼胚的生长发育，同时还影响遗传转化率，Car作为抑菌剂明显优于Cef，该结果与相关报道吻合[10]。在整个筛选过程中，采用双丙氨膦作为筛选剂和采用传统的草胺膦相比，大大降低了假阳性率。集合各优化因子建立了农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系，基于该体系已获得多种转基因玉米种质，分子检测结果证实该体系具有稳定的可重复性和高效性。该体系的建立丰富了玉米种质资源，开拓了玉米育种途径。
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