芸薹属ANR(BAN)基因家族RNA干扰载体的构建
摘要：花青素还原酶(ANR)是原花青素生物合成的关键酶，对种皮色素的积累起重要作用。黄子是油莱的重要优质性状，但甘蓝型油菜中其基因型缺乏，表型不稳定，分子机理不清。该实验克隆了芸薹属ANR基因家族的RNA干扰片段BANRI，将其反反片段、正义片段采用NcoI+AatII、BamHI+Xbal分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成重组载体pFGC5941M—BANRI(简称为pBANRI)，复合PCR鉴定表明载体构建成功，并转化根癌农杆菌菌株LBA4404，获得工程菌株。pBANRI的构建有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理。探索对油莱等植物种皮色素进行分子育种的可能性。
关键词：芸薹属；甘蓝型油菜；原花青素；ANR(BAN)；RNAi；载体
中图分类号：0782 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2010)04-0769-04
芸薹属(Brassica)植物甘蓝型油菜(B.napus L.)是世界上重要的油料作物之一，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)亲缘关系较近。在相同遗传背景下，黄子油菜比黑子油菜具有种皮薄，出油量高，油和饼粕中色素、木质素含量低等优点，因此黄子性状是油菜遗传改良的一个重要目标。甘蓝型油菜中不存在天然的黄子基因型，但通过远缘杂交培育的黄子甘蓝型油菜存在黄子表型欠稳定、一致性差的问题。
对拟南芥等植物的研究表明，主要种皮色素是原花青素(Proanthocvanidin.PA)，也叫缩合单宁。PA经公共苯丙烷一核心类黄酮一原花青素复合途径而合成，先后涉及12个关键酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3，H、DFR、LDOXJANS、LAR、ANR、LAC)的催化反应和3种转运蛋白(GST、MATE、ATPase)的胞内转运，并有6种转录因子(WIP ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)参与调控PA的合成与积累。花青素还原酶(Anthocyanidin reductase.ANR)位于花青素合成酶(ANS)的下游，将花青素转化成表儿茶素(2，3一顺式黄烷3-醇)。它是一类PA单体，随即向液泡转运并聚合成为缩合单宁，在拟南芥中ANR基因又被称为BANYULS(BAN)基因，因为该基因突变后种皮积累花青素而显红色。拟南芥中缺乏LAR.ANR／BAN是PA特异途径的第一个关键酶，而在其他多数植物中PA特异途径的第一个关键酶是LAR。它在LDOX之前可直接将DFR的产物无色花青素转变成2.3一反式黄烷3-醇，然后形成缩合单宁。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种转录后水平的基因沉默技术，相对于反义及共抑制技术，RNAi可获得更高的基因沉默效率：构建可转录为dsRNA的植物表达载体转化植物，可实现植物中目标基因的可遗传的基因沉默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。
此前本课题组采用RACE技术已经克隆了甘蓝型油菜ANR基因家族(BnANRI至BnANR4)、白菜ANR基因家族(BMNRI、BrANR2)和甘蓝ANR基因家族(BoANRI、BoANR2)的全长cDNA和基因组序列。在此基础上，本研究构建了芸薹属ANR基因家族的RNAi载体，将有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理，探索对油菜等植物种皮色素进行分子育种修饰的可能性。
1 材料和方法
1.1 材料
1)植物材料：甘蓝型油菜的一个黑子保持系5B的基因组总DNA和其生殖器官(蕾，花，开花后10、20、30 d的种子)混合总cDNA，由本实验室制备。
2)菌株和质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5ct、根癌农杆菌菌株LBA4404由本实验室保存，RNA干扰载体pFGC5941(AY310901.1)的DH5ct菌株购自俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心。pFGC5941M是由本课题组在pFGC5941的基础上改进而成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2／2)替换了pFGC5941上过长的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加了一个AatⅡ切点，使载体构建和鉴定更方便，更有把握高效地介导目标基因的沉默。
3)试剂：pMDl9-T载体、DNA Ligation Kit Ver.2.0、λ-HindⅢDNA marker为大连宝生物(TaKaRa)产品。Easy-Taq DNA聚合酶及Buffer、dNTPs、DL2000 plus DNA marker、琼脂糖等为北京全式金(Transgen)产品。Biospin胶回收试剂盒、Biospin质粒小量提取试剂盒为杭州博日(BioFlux)产品。限制性内切酶及Buffer为MBI Fermentas产品。引物(表1)合成和测序由上海英骏(1nvitrogen)商业完成。氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)等试剂购自上海生工。
1.2 芸薹属ANR基因家族干扰片段的扩增
以5B总cDNA为模板，采用引物组合FBAN，RI+RBANRI扩增芸薹属ANR基因家族干扰片段BANRI，50 IxL标准PCR体系含0.5μL模板和1.5UEasy-Tax／DNA聚合酶，反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性1 min.58℃退火1 min.72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。电泳照相后，切胶回收目的条带，与pMD19-T连接重组为DMD19-T-BANRI，转化DH5α，PCR阳性的克隆子菌液送样采用M13F测序。
1.3 芸薹属ANR基因家族RNA干扰载体的构建与鉴定
取DMD19-T-BANRI和DFGC5941M质粒，均进行Nco I+AatⅡ双酶切至完全，电泳后分别回收反义片段BANRIA和开环的oFGC5941M骨架，采用T DNA连接酶将二者于16℃连接12h、得到重组质粒pFGC5941M-BANRIA，转化DH5α，菌液PCR阳性的单克隆提取质粒。
采用BamH I+Xba 1分别对pMDl9-T-BANRI和pFGC5941M-BANRIA进行完全双酶切，电泳后分别回收正义片段BANRIS和开环的DFGC5941M-BANRIA骨架，采用L DNA连接酶将二者于16℃连接12 h，得到重组质粒pFGC5941M-BANRI，转化DH5a，对克隆子菌液进行复合PCR检测，阳性克隆子即为芸薹属ANR基因家族RNA干扰载体。
1.4 工程菌株的获得
从鉴定无误的大肠杆菌单克隆菌液中抽提pFGC5941M-BANRI质粒，用液氮冷激法转化根癌
农杆菌LBA4404(感受态细胞制备同DH5a).LB平后，除T载体条带外，产生了与预期683 bD一致的条带，另有一条500 bp左右的杂带，特异回收该683 bp的反义片段，记为BANRIA(图2A)。pFGC5941M经NcoI+Aα完全双酶切，得到了开环的载体骨架(图2B)，回收。BANRIA与pFGC5941M骨架连接，得到pFGC5941M-BANRIA转化DH5a，抗Kan单克隆菌液采用引物组合RB-nPAP212+RBANRI和F35S3N+FBANRI进行PCR鉴定，分别扩增出了与预期864 bp和801 bp一致的条带(图2C)，说明反义片段已按正确方向插入到启动子与间隔区之间，形成了中间载体pFGC5941M-BANRIA。
采用BamH I+Xba I对pMDl9-T-BANRI和pFGC5941M-BANRIA质粒进行双酶切，前者产生了与预期695 bp一致的正义片段BANRIS(图2D)。后者产生了与预期一致的pFGC5941M-BANRIA开环骨架(图2E)，回收二者，连接重组，得到干扰载体pFGC5941M-BANRI。转化DH5ct。抗Kan单克隆菌板和单克隆菌液均采用Kan(100 mg／L)、Rif(40mg/L)和Str(20 mg/L)三重筛选，菌液PCR鉴定同1.3，阳性单克隆培养后作为植物转化的工程菌株。
2 结果与分析
2.1 芸薹属ANR基因家族干扰片段的克隆
引物组合FBANRI+RBANRI扩增5B总cDNA模板后，PCR产物电泳后得到一条与预期大小一致的特异条带(图1)。将其回收，与pMDl9-T连接，转化DH5a，PCR阳性的2个单克隆菌液测序后实际长度均为697bp，序列一致，它对应于BnANR2基因，与其mRNA对应区段只相差4个碱基，估计是等位基因间的SNP差异所致(图1)。
2.2 芸薹属ANR基因家族RNA干扰载体的构建与检测
pMD19-T-BANRI经Nco I+AαⅡ完全双酶切液采用引物组合FBnPAP212+RBANRI和ROC，ST5N+FBANRI进行检测，扩增出了与预期878bp和816bp一致的条带(图2F)，说明正义片段已按正确方向插入到间隔区与终止子间。同时。对单克隆菌液还采用F35S3N+RBnPAP212和FBnPAP212+ROCST5N进行PCR。再次验证反义片段和正义片段插入的位置和大小，结果分别扩增得到与预期968 bp和997 bp一致的片段(图2G)。综合PCR鉴定表明，BnANRIA片段在35S启动子与间隔区之间反义插入，BnANRIS片段在间隔区与终止子之间正义插入，两个片段的插入大小和方向均正确，表明RNA干扰载体pFGC5941M-BANRI(简称为pBAN-RI)构建成功(图3)。
2.3 重组载体转化根癌农杆菌及鉴定
提取2.2中鉴定正确的DH5ct单克隆的质粒，采用冻融法导入根癌农杆菌菌株LBA4404，获得抗Karl、Rif和Str的菌落。抗性单克隆的菌液采用与2.2一样的复合PCR鉴定，取得完全一样的结果，表明干扰载体pBANRI已成功转入到LBA4404中，载体结构保持完整，形成了工程菌株，可直接用于植物转化。
3 讨论
植物中普遍存在基因家族现象，RNAi既可用于对不同成员进行分别沉默，也可用于对整个家族进行有效沉默，因此基因沉默也可以作为功能基因研究和分子育种的重要工具：保守区构建的RNA干扰片段与靶基因的一致性即使低至72％左右，也仍然会介导一定程度的基因沉默。本课题组经过克隆和Southern杂交表明，甘蓝型油菜只有4条ANR基因(RnANRl-BnANR4)，亲本物种白菜有2条ANR基因(RANRl和BrANR2)，甘蓝有2条ANR基因(BoANRl和BoANR2)，BnANRl、BnANR2起源于BoANRl、BoANR2；BnANR3、BnANR4起源于BrANRl、BrANR2；来自3个物种的8条ANR基因之间在全长mRNA水平的一致性介于83.5％。99.8％.RNA干扰片段BANRI与BnANRI、BnANR2、BnANR3、BnANR4、BrANRl、BrANR2、BoANRl、BoANR2在mRNA水平的一致性分别达到88.7％、99.4％、90.4％、98.2％、90.1％、98.2％、88.6％、100.0％，因此理论上推测干扰载体pFGC5941M-BANRI可用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等多个芸薹属物种的转基因，介导ANR基因家族的高效沉默。而且该载体不会引起对DFR等基因的非靶向沉默。
本课题组在将DFGC5941改进成pFGC5941M时引入的AatⅡ切点有助于在启动子与间隔区之间插入干扰片段，但pMD19-T的TA克隆位点的M13F一侧的500bp上游存在一个一AatⅡ切点，所以本研究在用Nco I+AatⅡ从重组oMD19-T载体上切下反义片段时，伴随产生了一个500bo左右的载体片段，对目标片段的判断和切胶产生了一些干扰。如果用pGEM-T系列载体代替pMD19-T系列，则不存在该现象，因为它们的AatⅡ位于多克隆位点中，酶切虽然会产生一个44bo以下的极短杂片段，但它不会妨碍对目标基因片段的判断和切胶。