左归降糖益肾方对MKR糖尿病肾病小鼠足细胞葡萄糖调节蛋白78、C/EBP同源蛋白表达的影响
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摘要：目的 观察内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）在MKR转基因糖尿病肾病（DN）小鼠足细胞的特异性表达及左归降糖益肾方的干预作用。方法 以8周龄MKR小鼠为研究对象，随机分为空白组、模型组、左归降糖益肾方组、4-苯基丁酸组、格列喹酮片+贝那普利组，以C57野生鼠为正常组，每组10只。采用高脂喂养加单肾切除复制DN模型，各给药组予相应药物灌胃30 d。采用电化学法观察小鼠空腹血糖（FBG），ELISA测定尿微量白蛋白（UmAlb），RT-PCR及Western blot检测GRP78、CHOP基因和蛋白表达，电镜观察足细胞形态结构。结果 与空白组比较，模型组FBG、UmAlb明显升高（P<0.01），足细胞GRP78基因及蛋白表达明显下调（P<0.01），CHOP基因及蛋白表达明显上调（P<0.01）；与模型组比较，各给药组FBG、UmAlb明显降低（P<0.01），左归降糖益肾方组、4-苯基丁酸组GRP78 基因及蛋白表达明显上调、CHOP基因及蛋白表达明显下调（P<0.01）。电镜观察结果显示，各给药组小鼠肾小球足细胞结构、数量及密度较模型组明显改善。结论 左归降糖益肾方能改善内质网应激介导的足细胞损伤，延缓DN进展。
关键词：糖尿病肾病；左归降糖益肾方；MKR小鼠；内质网应激；足细胞；葡萄糖调节蛋白78；C/EBP同源蛋白
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.03.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）03-0065-04
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，其发生发展与糖代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、细胞因子异常表达、遗传基因易感性等诸多因素有关。近年来研究提示内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的足细胞损伤在导致DN蛋白尿及肾小球硬化方面起着重要作用，而针对ERS的药物研究也成为热点。目前已发现化学分子伴侣4-苯基丁酸通过调控ERS强度，抑制肾皮质的氧化应激和炎症激活，抑制ERS介导的细胞凋亡[1]，并通过缓解胰岛素抵抗，降低血糖[2]，影响DN进展。左归降糖益肾方由左归丸化裁而来，具有滋阴益气、活血解毒之效。前期研究已明确其降低血糖、改善糖耐量、抑制炎症因子和氧化应激作用[3]，并具有维持足细胞结构相关蛋白nephrin、podocin表达，保护足细胞、减少蛋白尿、改善糖尿病早期肾脏损伤的作用[4]。而该方对足细胞的保护机制仍不十分明确。本实验观察ERS相关分子葡萄糖调节蛋白78 （GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）在MKR转基因DN小鼠足细胞的特异性表达及左归降糖益肾方的干预作用，为DN的临床治疗提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
MKR小鼠为骨骼肌特异性Insulin/IGF-1双受体缺失的转基因2型糖尿病小鼠，美国国立卫生研究院糖尿病研究中心Dr.D.LeRoith提供，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号SYXK（湘） 2009-0001，经自然交配繁殖；C57野生鼠，湖南中医药大学刘伯炎老师惠赠，许可证号SYXK（湘）2013-0005。
1.2 药物与饲料
左归降糖益肾方（熟地黄18 g、山萸肉12 g、黄芪18 g、丹参9 g、牛膝9 g等9味），购自湖南中医药大学第一附属医院药房。水煎2次，混合后浓缩成为2 g原药材/mL药液，经灭菌后4 ℃保存备用。4-PBA（德国进口，lot：STBB 6241V）用蒸馏水37 ℃溶解，制成浓度为0.5 g/mL溶液。格列喹酮片（30 mg/片，北京双鹤药业有限责任公司，批号1120337）和贝那普利片（5 mg/片，深圳信立泰药业股份有限公司，批号20120901）按3∶1比例用蒸馏水制成浓度分别为0.79、0.26 mg/mL的混合药液。高脂饲料由普通饲料加15%猪油、1%胆固醇组成，由湖南中医药大学SPF级实验动物中心加工制成。
1.3 主要仪器与试剂
Thermo高速冷冻离心机；BioTek酶标仪；日产HT7700 型透射电镜；日立7150全自动生化分析仪（日本）；Thermo -80 ℃冰箱，Leica石蜡切片机；北京六一牌垂直电泳仪及转膜系统；Eppendorf核酸蛋白分析仪。尿微量白蛋白酶联免疫检测试剂盒（上海同田生物技术有限公司，批号20140110）；Simply P总RNA提取试剂盒（BioFlux，lot20131001）；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，型号CW0744）；引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（上海诺伦生物医药技术有限公司，NL128）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
选取8周龄MKR小鼠40只（经过遗传鉴定[5]），按照性别、空腹血糖（FBG）和体质量分层，随机分为空白组、模型组、左归降糖益肾方组（中药组）、4-苯基丁酸组、格列奎酮+贝那普利组（阳性药组），另以C57野生鼠为正常组，每组10只。正常组与空白组以普通饲料喂养；其余各组造模，以高脂饲料喂养加右侧单肾切除[6]。
2.2 给药与样本处理
术后4周开始给药，阳性药组灌胃剂量分别为7.9、1.3 mg/（kg·d），灌胃量10 mL/kg；4-苯基丁酸组灌胃剂量为29 g/（kg·d），灌胃量5.8 mL/kg；中药组灌胃剂量为28 g/（kg·d），灌胃量14 mL/kg；其余各组均以等量蒸馏水灌胃，连续4周。各组小鼠心脏采血后取肾，剪取20 mg肾皮质液氮中保存，50 mg肾皮质-80 ℃保存，其余部分多聚甲醛固定。
2.3 观察指标
2.3.1 生化指标检测 灌胃前1 d及灌胃4周后，各组小鼠禁食不禁水5 h，尾静脉采血，电化学法血糖仪检测FBG；留取随机尿，采用ELISA检测尿微量白蛋白（UmAlb）。
2.3.2 肾组织透射电镜观察 取约1 mm3大小肾皮质用于电镜观察。
2.3.3 RT-PCR法检测肾小球足细胞葡萄糖调节蛋白、C/EBP同源蛋白基因的表达 取20 mg肾皮质，按总RAN提取试剂盒操作步骤提取RNA，核酸蛋白分析仪检测RNA浓度。取1 μg总RNA合成cDNA。引物：GAPDH（500 bp）上游5"-GCTCACTTGAAGGGTGG-3"；下游5"-CCATTCGTTGTCGTACCA-3"；GRP78（399 bp）上游5"- CTGGGTACAATTTGATCTGACTGG；下游5"-GCATCCTGGTGG CTTTCCAGCCATTC-3"；CHOP（217 bp）上游5"-CACCTA TATCTCATCCCCAGGA-3"；下游5"-ACCACTCTGTTTCCGTTT CCTA-3"。PCR扩增条件：预变性95 ℃、4 min，变性94 ℃、30 s，GAPDH：退火60 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环；CHOP：退火55 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；GRP78：退火58℃、30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环。72 ℃继续延伸10 min。取PCR产物5 μL于1.2%琼脂糖电泳，100 V、40 min。凝胶成像系统予PCR定量分析，取目的基因与内参GAPDH的光密度值之比，进行统计分析。
2.3.4 Western blot检测肾小球足细胞葡萄糖调节蛋白、C/EBP同源蛋白蛋白表达 总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法蛋白定量，每孔加50 μg蛋白样品，丙烯酰胺垂直电泳，上层4%浓缩胶，80 V，下层10%分离胶，120 V。转膜100 V、2 h，5%脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，加一抗孵育2 h，TBST清洗，二抗孵育2 h，TBST清洗后于ECL化学发光系统分析，取目的基因与内参GAPDH的光密度值之比，进行统计分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，符合正态性和方差齐性的资料采用方差分析、多重比较，不符合则采用非参数分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组小鼠肾皮质病理变化
电镜观察结果显示，正常组小鼠足细胞结构正常，足突排列整齐；与正常组比较，模型组系膜增厚明显，足突融合，裂孔膜增宽，足细胞数目减少，密度降低；与模型组比较，各给药组基底轻度增生，足细胞病变情况明显改善，见图1。
4.2 左归降糖益肾方对小鼠空腹血糖及尿微量白蛋白的影响
与正常组比较，空白组、模型组FBG、UmAlb明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组FBG、UmAlb明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与4-苯基丁酸组比较，中药组及阳性药组FBG明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
4.3 左归降糖益肾方对小鼠内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白、C/EBP同源蛋白基因及蛋白表达的影响
与正常组比较，空白组与模型组GRP78基因及蛋白表达水平明显降低，CHOP基因及蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药组及4-苯基丁酸组GRP78基因及蛋白表达水平明显升高，CHOP基因及蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表2、表3、图2。
5 讨论
足细胞是导致DN出现蛋白尿的关键细胞，受到体内高糖、脂质代谢障碍等因素刺激而易诱发ERS。GRP78是发生ERS的标志蛋白，参与蛋白质在内质网中的糖基化修饰，并对其折叠、装配和运输具有重要的作用。GRP78表达水平与DN足细胞损伤程度密切相关[7]，早期ERS通过提高内质网分子伴侣GRP78表达，促进错误合成蛋白的正确折叠和转运，维持内环境稳态，保护足细胞；晚期DN，足细胞在长期刺激下引起ERS过度，GRP78表达下调，并激活内质网相关性死亡途径，诱导损伤足细胞的凋亡[8]。CHOP是发生过度ERS的标志，也是细胞凋亡途径中的关键分子之一[9]，敲除CHOP基因可减少ERS导致的小鼠肾损伤[10]。Wu J等[11]发现，过度ERS致肾组织CHOP转录活性增强，尿蛋白增高，并伴有肾小球硬化和肾小管间质纤维化。
DN属中医“消渴”“下消”范畴，病位主要在肾，与肺脾等也有一定的关系。现代研究表明，气血两虚兼燥热津凝湿聚、血脉瘀阻为本病的主要病机。并有学者指出DN当重视“痰瘀”或“毒损肾络”。叶景华教授认为DN发病的内在原因是脾肾亏虚，瘀血阻滞[12]；本课题组认为DN以脾肾亏虚为本，阴虚燥热、血中伏火所致浊毒成瘀为标，虚、毒、瘀共为此病。
本实验中，模型组FBG、UmAlb明显升高，加速MKR小鼠的DN进展。肾足细胞结构损伤，密度、数量减小，以及ERS标志分子GRP78表达下调和CHOP表达上调，提示足细胞损伤与蛋白尿的关联性，以及DN过程中产生了ERS，并介导足细胞损伤。经药物治疗后，左归降糖益肾方与阳性药物方均能明显降低FBG；同时，该方与4-苯基丁酸均可通过调控ERS标志分子表达，抑制过度ERS对小鼠肾结构及功能损伤，延缓DN进展。
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（收稿日期：2014-07-12；编辑：华强）