七叶皂苷钠通过抑制AKT，ERK上游信号SRC活性诱导人乳腺癌MCF—7细胞凋亡

材料与方法

1.1材料人乳腺癌MCF-7细胞株由本实验室保存。七叶皂苷钠购自上海阿拉丁试剂公司;DMEM完全培养液，胎牛血清购自Hyclone公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），DAPI购自美国Sigma公司;AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自BD公司;PARP，pro-caspase-3，cleaved-caspase-8，phospho-p42/44MAPK（Thr202/Tyr204），phospho-AKT（Ser473），phospho-SRC（Tyr416）和β-actin抗体购自CellSignalingTechnology公司;GAPDH单克隆抗体购自Bioword公司;IRDye800荧光标记二抗购自Odessey公司。

1.2细胞培养人乳腺癌MCF-7细胞株用含10%胎牛血清和抗生素（100U·mL-1青霉素和100mg·L-1链霉素）的DMEM完全培养液，在37℃，5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3MTT检测法细胞存活率用细胞将MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒的能力来衡量。将MCF-7细胞提前24h接种于96孔板，细胞密度为5×104。用不同浓度（5，10，20，40，60，80，100mg·L-1）七叶皂苷钠分组处理细胞36h后，每孔加入20μLMTT（5g·L-1），继续培养4h，加入150μL二甲基亚砜（DMSO）溶解蓝紫色结晶。每组设5个复孔，同时设置空白对照组，溶剂对照组和空白调零组。空白对照组细胞不做任何处理，溶剂对照组加入药物溶剂DMSO，空白调零组只加入DMEM完全培养液，不加入细胞。酶标仪检测各孔570nm波长吸光度，细胞存活率用下面公式计算，细胞存活率=（A实验组-A空白调零孔）/（A空白对照组-A空白调零孔）×100%。

1.4细胞形态学观察将MCF-7细胞提前24h接种于6孔板，密度为2×105个/mL，细胞贴壁后，换新鲜培养液，除空白对照组和溶剂对照组外，加入终浓度分别为10，20，40mg·L-1七叶皂苷钠，24h后倒置显微镜下观察细胞形态学变化，并拍照（×200）。

1.5DAPI染色法细胞处理及分组同1.4项，吸尽各组细胞培养液，加入PBS漂洗3次，每次3min。每组加入1mLDAPI（1mg·L-1）避光染色3min，再用PBS避光洗3次，荧光显微镜下观察各组细胞核变化情况，并拍照分析。

1.6流式细胞术收集各组细胞样品，冷PBS洗2次，800r·min-1离心收集细胞，分别加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI重悬细胞，避光孵育15min，加入l×Bindingbuffer400μL。流式细胞术检测4个象限细胞数，分析细胞凋亡率，每次计数1×104个细胞。

1.7免疫印迹收集各组细胞裂解物，4℃，15000×g离心15min，收集上清液。Bicinchoninicacid（BCA）法测定样品蛋白质浓度，加入2×上样缓冲液，煮沸5min，4℃保存。依据蛋白质浓度测定结果上等量样品，进行SDS-PAGE（10%或12%）后，将蛋白转移至NC膜上。用含5%脱脂奶粉的TBS封闭液，室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，吸尽一抗，加入荧光标记二抗室温避光孵育1h，用Odyssey红外双色激光成像系统扫描并分析信号条带灰度值。

1.8统计学处理用SPSS13.0软件对数据进行处理，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为有显著性差异。

2结果

2.1七叶皂苷钠抑制MCF-7细胞增殖七叶皂苷钠对细胞增殖的抑制作用具有量效关系。用不同浓度七叶皂苷钠预处理MCF-7细胞36h后，细胞存活率显著减少，见图1。为了更直观的反映七叶皂苷钠对MCF-7细胞生长状态的影响，在倒置显微镜下观察细胞数量和外形的变化。在空白对照组和溶剂对照组细胞生长状态良好，轮廓清晰，呈铺路石状排列。在10mg·L-1组大部分细胞贴壁生长，少数细胞脱壁，呈圆形，折光度增加，在40mg·L-1组仅有少数细胞贴壁，且边缘模糊，大部分细胞脱落，漂浮，见图2。

2.2七叶皂苷钠诱导MCF-7细胞凋亡在空白对照组和溶剂对照组，细胞凋亡率分别为3.56%，4.58%，而用10mg·L-1七叶皂苷钠处理24h后，细胞凋亡率增加到10.44%，随着七叶皂苷钠浓度的升高，40mg·L-1组细胞凋亡率为32.76%。因此，七叶皂苷钠能够以剂量依赖方式显著诱导细胞凋亡。另外，DAPI染色后，荧光显微镜下，在七叶皂苷钠处理组，也能观察到典型的凋亡细胞核形态改变。在空白对照组和溶剂对照组，细胞核均匀蓝染，形态规则，呈椭圆形，在七叶皂苷钠处理组，凋亡细胞核呈现蓝色高亮区，外形呈半圆形或梭形，见图3。

2.3七叶皂苷钠触发凋亡相关蛋白切割无论是外源性死亡途径还是内源性死亡途径，都涉及到半胱氨酸蛋白酶家族的切割活化，进而引起其底物PARP的切割^[9]。因此，作者运用Westernbloting方法检测了MCF-7细胞内凋亡相关蛋白的变化。在空白对照组和溶剂对照组，cleavedcaspase-8基本无表达，pro-caspase-3表达量基本不变，未见PARP切割条带。而在七叶皂苷钠处理组，随着药物浓度的增加，cleavedcaspase-8表达量逐渐增加，pro-caspase-3蛋白水平逐渐减少，PARP切割条带显著上调，见图4。进一步证实了七叶皂苷钠对MCF-7细胞的凋亡诱导作用。

2.4七叶皂苷钠抑制AKT/ERK激酶的活化研究证实，AKT和ERK信号分子在乳腺癌细胞中发挥着重要的调控作用，也是很多化疗药物的作用靶点^[10]。因此，为了阐明七叶皂苷钠诱导细胞凋亡的具体分子机制，作者检测了七叶皂苷钠作用前后，AKT和ERK磷酸化变化情况。在空白对照组和溶剂对照组，AKT和ERK磷酸化组成性激活，但用七叶皂苷钠处理后，AKT和ERK的活化受到显著的抑制，尤其在40mg·L-1高浓度组，AKT和ERK的磷酸化信号非常弱，见图5。所以，七叶皂苷钠可能通过阻断细胞内与细胞存活相关信号途径，启动凋亡程序。

2.5七叶皂苷钠下调SRC激酶活性除了分别受到各自的上游激酶PI3K和MEK1的激活，AKT和ERK还受到共同的上游信号分子SRC的调控^[11]。

为了寻找七叶皂苷钠诱导细胞凋亡的靶蛋白分子，作者检测了SRC激酶在MCF-7细胞内的活化状态。作者的实验结果证实，正如作者预期的一样，SRC的磷酸化变化趋势和AKT，ERK一致。在空白对照组和溶剂对照组，SRC磷酸化水平很高，七叶皂苷钠处理4h后，细胞内SRC激酶活性受到明显的抑制，见图6。因此，七叶皂苷钠可能通过调控SRC激酶活性，阻止信号向下游AKT和ERK传递，削弱细胞存活相关信号，诱导细胞凋亡的发生。

3讨论

由于目前乳腺癌的治疗现状不尽如人意，因此寻找新的治疗方法成为当务之急。其中，天然提取物以其取材丰富，毒副作用小等优势逐渐成为研究的焦点^[12-15]。七叶皂苷钠是从娑罗子中天然提取得到的三萜皂苷钠盐，有文献报道其具有抗肿瘤活性。本研究证实，七叶皂苷钠可以显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。众所周知，细胞凋亡是机体清除多余细胞，维持内环境稳定的重要途径。诱导肿瘤细胞凋亡也成为大部分抗肿瘤药物的关键机制。作者的实验结果表明，七叶皂苷钠能够引起MCF-7细胞内多种凋亡指标的发生，细胞凋亡率显著增加;细胞贴壁性差，外形皱缩;典型凋亡细胞核改变;caspase家族蛋白活化，导致其底物PARP切割。至此，本研究证实七叶皂苷钠通过诱导MCF-7细胞凋亡，进而抑制细胞增殖。

细胞内有多条蛋白激酶途径与细胞存活和细胞增殖有关。丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs），据证实在多种细胞模型中，参与调控细胞凋亡和细胞周期相关信号通路。MAPKs包括3个主要成员，分别是细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular-signalregulatedproteinkinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Junamino-terminalkinase，JNK）和p38MAPK。总的来说，JNK和p38被多种刺激，例如氧化应激、紫外照射和渗透压变化等激活后，主要发挥凋亡诱导作用^[16]。相反，ERK在细胞增殖和分化中扮演着重要角色，一般认为它是细胞存活调节子^[17]。除了MAPKs外，另外一个蛋白激酶AKT，通过磷酸化激活一系列下游底物，包括Bad，GSK3β和FOXO转录因子，介导细胞增殖过程^[18]。目前，关于七叶皂苷钠的抗肿瘤活性是否与AKT和ERK信号通路有关，尚未见报道。作者的实验结果表明，AKT和ERK在MCF-7细胞中组成性激活，七叶皂苷钠处理后，AKT和ERK的磷酸化水平显著下调，且呈量效关系。

SRC属于非受体酪氨酸激酶家族，在多种肿瘤组织中，包括大肠癌、乳腺癌和前列腺癌等组成性高表达^[19]。SRC的下游信号分子仍处于研究阶段，但实验已经证实SRC与细胞内细胞存活相关信号通路存在相互作用^[20-21]。在本研究中，作者检测到乳腺癌MCF-7细胞内SRC呈高表达，在七叶皂苷钠处理后，同AKT，ERK磷酸化变化趋势相同，SRC活化水平显著降低。SRC有可能是AKT，ERK蛋白激酶的共同上游信号分子。在MCF-7细胞中，SRC/AKT，ERK信号通路主要传递细胞存活信号，发挥细胞保护作用，而七叶皂苷钠阻止SRC的激活，进而使下游蛋白激酶AKT和ERK处于抑制状态，失去细胞保护作用，进而触发凋亡机器。

综上所述，本研究证实七叶皂苷钠能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导细胞凋亡。并初步阐明了七叶皂苷钠发挥抗肿瘤作用的具体分子机制。七叶皂苷钠通过抑制SRC激酶活性，阻断信号向AKT，ERK传递，破坏细胞内细胞存活与细胞死亡之间的动态平衡，使细胞向凋亡方向发展。作者的实验数据提示，七叶皂苷钠具有作为临床抗肿瘤药物的巨大潜力，为指导七叶皂苷钠的临床用药提供了理论和实验依据。

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[责任编辑张宁宁]

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