山东省鸡源大肠埃希菌I类整合子及基因盒研究
摘要：研究了从山东省济南、德州等市肉鸡场分离的大肠埃希菌中Ⅰ类整合子及基因盒的流行状况。结果表明，整合酶基因检出率为53%；Ⅰ类整合子基因盒检出率为50%，大小为1 085～2 360 bp，100株细菌中各含1～2个基因盒，其中dfrA17+aadA5检出率最高。Ⅰ类整合子在多重耐药大肠埃希菌中广泛流行，是细菌多重耐药性产生和扩散的重要机制，养殖场应科学用药，加强耐药性监测。
关键词：整合子；基因盒；耐药性；大肠埃希菌；鸡源；山东
中图分类号：S858.31文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0017-04
1989年Strokes和Hall首次提出整合子的概念。整合子存在于多种细菌中，是一种可移动的DNA元件，可捕获、剪切和整合外源性耐药基因并进行表达，且可以通过接合性质粒或转座子，使多重耐药基因在细菌中扩散。整合子/基因盒系统发现至今已经报道了60多种基因盒，以dfrA（甲氧苄氨嘧啶耐药相关）和aadA（氨基糖苷类耐药相关）基因家族为主，也在少数菌株中发现了aacA4、cmlA1、catB3、sat1以及blam-1基因盒编码氨基糖苷类、氯霉素、链丝菌素、β-内酰胺类等多种抗菌药物[1]。目前，国内外人源和动物源大肠埃希菌Ⅰ类整合子研究[1～12]虽然不少，但针对山东省肉鸡养殖场的大肠埃希菌的研究尚未见报道。本试验主要研究从济南、德州、济宁、淄博、聊城、烟台、青岛等市养鸡场分离的大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的分布，以探讨Ⅰ类整合子耐药基因盒在山东省有关市的养鸡场的流行情况。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1试验菌株200株鸡源大肠埃希菌，采自山东省各地市养鸡场，由本研究室鉴定保存。
1.1.2试剂TaKaRa Ex Taq （5 U/μL），内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、AccⅠ、FokⅠ，DNA分子量标准：DL 2000 （50 ng/μL）、250 bp DNA ladder， 均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.3药敏纸片抗生素药敏纸片：磺胺甲基异恶唑/甲氧苄啶（SMZ/TMP）、庆大霉素、链霉素、壮观霉素、强力霉素、氨苄西林、氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、阿莫西林，购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.4试验仪器PCR扩增仪（ABI公司）；电泳凝胶成像系统（BIO-RAD公司）；水浴振荡培养箱；数显多槽循环水浴锅；台式高速离心机，全自动高压灭菌器（日立）；超净工作台（苏州净化仪器设备有限公司）；冰箱（松下）。
1.2试验方法
1.2.1引物的设计及PCR扩增根据GenBank收录的Ⅰ类整合子序列，参考高迎春等[9]设计扩增Ⅰ类整合酶基因的引物intI-F、intI-R（预期扩增片段长度为280 bp）以及扩增可变区（基因盒）的引物gcst-F、gcst-R（扩增片段长度不等），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。两对引物各自在合适的PCR反应条件下进行扩增。引物序列、DNA模板的制备、PCR反应体系、PCR循环条件、PCR产物的电泳分析方法见参考文献[9]。
1.2.2基因盒PCR产物测序每种基因盒选取3株大肠埃希菌，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。基因盒测序结果经Blastn检索GenBank数据库（.cn/qkpdf/nykx/nykx201409/nykx20140904.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文
200株大肠埃希菌对10种药物呈现不同程度的耐药性。对强力霉素的耐药率为52%（104株）；对SMZ/TMP的耐药率为55%（110株）；对氯霉素的耐药率为33%（66株）；对氨基糖苷类药物的耐药率为48%～65%；对氨苄西林耐药率为45%（90株）；对阿莫西林的耐药率为54%（108株）；对氟喹诺酮类药物的耐药率为42%～55%。且同类药物间存在着部分交叉耐药性，多重耐药现象严重。
携带基因盒的菌株至少对4种药物具有耐药性，最多耐10种药物。携带2 360 bp整合子的菌株100%同时对氯霉素、链霉素和壮观霉素耐药。携带1 085 bp整合子的菌株100%同时对链霉素和壮观霉素耐药；35株携带1 989 bp整合子的菌株100%对壮观霉素和甲氧苄啶耐药，但只有60%（21/35）的菌株对链霉素耐药，40%的菌株对链霉素敏感，原因不明确；60株携带1 740 bp整合子的菌株100%对壮观霉素和链霉素耐药。100株携带整合子基因盒的菌株100%对磺胺甲基异恶唑和甲氧苄啶耐药。由此可见大肠埃希菌携带的整合子/基因盒与耐药表型密切相关。
3结论与讨论
3.1在Ⅰ类整合子中共检测到4种大小不同的片段，主要含有编码对氯霉素、甲氧苄啶、壮观霉素、链霉素耐药性的基因盒。基因盒的总体携带率为50%，其中有47株菌同时携带2种不同的基因盒。基因盒检出率较高的是dfrA17+aadA5和protein cmlA1-variant-like gene、AAC（6′）-Ib，其次为dfrA12+aadA2和aadA2，这与其它报道耐药大肠杆菌Ⅰ类整合子分布情况部分相符[1～10]。相关基因盒阳性的菌株，基因型和耐药表型基本一致；携带基因盒的菌株对磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、甲氧苄啶耐药；部分菌株对链霉素和壮观霉素交叉耐药。基因盒阴性的部分菌株有不同的耐药表型，如对强力霉素、氟喹诺酮类药物和β-内酰胺类的耐药性，可能与其他耐药机制如抗生素主动外排泵系统或位于其他DNA上的药物水解酶、灭活酶、金属酶、拓扑异构酶的改变等相关。
3.2cmlA氯霉素外排基因在志贺菌属和铜绿假单胞菌中有类似的报道，但在大肠杆菌中报道较少。美国国立生物信息中心（NCBI）登记的cmlA基因多位于细菌整合子上，少数位于转座子上，其表达产物CmlA转运蛋白位于细菌内膜[11，12]，它与细菌内源性的外排系统共同作用，当整合子整合了外排泵基因和氨基糖苷类修饰酶乙酰转移酶基因时，多重耐药性更加严重。说明细菌的耐药性往往不是单独作用的，有些是几种耐药机制协同作用的结果，不同的耐药基因通过整合子的组合、重新排列，不断增生繁殖扩散，耐药形势更为严峻。
3.3一个整合子可以捕获一个或多个基因盒，同时一个基因盒可以整合到不同的整合子上，从而导致基因盒的移动[2，3]；且整合子携带的基因盒可以插入到转座子或接合质粒中，在不同的细菌中运动从而扩散耐药性。整合子及基因盒系统引起的耐药性足以引起我们的高度重视，需积极采取相应的措施进行防范。氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类药物是临床常用的药物，山东省各地市养殖场因用药习惯不同，耐药性略有差异，但总体差异不显著，多重耐药结果相当严重。
3.4肉鸡作为人类重要的蛋白质来源，是家庭餐桌的必备。但基因测序表明，鸡源大肠杆菌整合子基因盒与人类分离的相关基因的同源性高达98%，不排除通过食物链或环境感染人的可能性。关于动物源耐药菌通过环境或者食物链传给人，引起人类治疗失败的案例逐年增多。在动物源耐药菌对人类健康影响的风险评估中，后果评估是一个极其重要的组成部分，需要我们投入更多的资金和精力进行细致的调研及评估，完善风险评估系统以及风险预警系统。另外，需在养殖场通过药敏试验或耐药基因监测及时调整并科学合理地选择药物，不断降低盲目用药带来的耐药性风险，不断提高畜禽产品质量安全和公共卫生安全。
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