针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染
[摘要] 目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体，构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体，并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株（BRL），以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。 方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体。应用脂质体转染技术，将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株（BRL），并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。 结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450，通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL，在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象。 结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450，可通过质粒转染方法转染至BRL细胞。
[关键词] HP450基因；质粒转染；BRL细胞株
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）10（b）-0004-03
原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，过去尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段，但患者生存率并无明显改善，也未能从根本上解决肝癌转移和复发的问题[1]。随着分子生物学、细胞生物学等学科的飞速发展，肿瘤生物治疗越来越受到重视。
抗组胺药敏感性细胞色素P450（简称HP450）主要存在于肝脏微粒体，HP450在肝脏疾病发展过程中具有一定的规律性和相关性[2-4]，有可能作为肝癌诊断的一个新指标和治疗肝癌的一个新靶点。
本实验以HP450基因作为研究靶点，利用先进的RNAi技术，构建shRNA真核表达载体，将该载体经脂质体转染大鼠正常肝细胞株BRL，研究质粒转染后对HP450基因表达及BRL细胞增殖的影响，为今后研究HP450基因对BRL细胞功能的影响提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器设备 超净工作台（AIRTECH公司）、5% CO2恒温培养箱（美国BIO-RAD公司）、倒置相差显微镜（日本奥林巴司公司）、大容量冷冻高速离心机（德国Eppenndorf Centrifuge公司）、-80℃超低温保存箱（海尔公司）、电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）、AB204-E分析天平（瑞士梅特勒一托利多公司）、紫外可见分光光度计（Thermo基因有限公司）、SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、高压灭菌消毒锅（日本TOMY公司）、微量移液器（德国Eppendorf公司）、微波炉（广东格兰仕家电集团）。
1.1.2 细胞培养材料 大鼠肝细胞株BRL购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号：SH30022.01B）、二甲基亚砜（DMSO，上海市欣诚化工有限公司，批号：CAS：67-68-5）、磷酸盐缓冲液（PBS，北京索莱宝生物科技有限公司，型号：H1045）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝生物科技有限公司，型号：T1300）、胎牛血清（杭州四季青公司，型号：HB0205）。
1.1.3 质粒转染材料 pGPH1/GFP/Neo质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，No.11668-027。
1.1.4 RT-PCR引物设计材料 根据H1 mRNA全长序列（GeneBank ID：24448），由广州GeneCopoeia公司设计合成，扩增产物片段大小为154 bp，引物序列如下：上游：5"-ttcttctccttcctgtgggtta-3"（Lenth：22，Tm：61.9，GC：60）； 下游：5"-tcctacactggggtctcttgat-3"（Lenth：22，Tm：61.9，GC：60）。内参引物F18由上海生工生物工程有限公司合成，扩增产物片段大小为207 bp，序列如下：上游：5"-cacccgcgagtacaaccttc-3"（Lenth：20，Tm：60.7，GC：50）；下游：5"-cccatacccaccatcacacc-3"（ Lenth：22，Tm：60.07，GC：50）。
1.1.5 试剂的配置 ①PBS缓冲液：将PBS干粉倒入干净的烧杯中，加入2000 mL三蒸水，用玻棒稍搅拌后，放入磁力搅拌子，转移烧杯至磁力搅拌器上，调整合适转速，5 min左右即可完全溶解。之后用pH计测量其pH值，如若pH值未在预定范围中，用NaOH或浓HCl将其pH值调至7.2～7.4，分装入容量为500 mL的干净玻璃瓶中，高压灭菌后备用。②0.25%胰酶消化液：称取0.25 g胰酶加入100 mL PBS缓冲液，分装，过滤即可。
1.2 细胞株的培养
BRL细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，放置于37℃含有5%的CO2培养箱中培养，每隔2～3 d传代培养。
传代培养：用PBS洗2次培养瓶，弃掉PBS，加入2 mL 0.5%的胰酶，置37℃ 5% CO2培养箱消化2 min，加入含有胎牛血清的DMEM培养基5 mL终止消化，轻度吹打瓶壁，使细胞脱落，然后移至10 mL的离心管，1000 r/min，5 min离心，去掉上层液体，重新加入含胎牛血清的DMEM培养基5 mL，吹打混匀，接种至培养瓶进行培养。
1.3 脂质体介导的质粒转染
脂质体/质粒DNA混合物的准备：①Solution A：取干扰质粒、阴性对照质粒各9 μL分别加入1.5 mL EP管内，分别加入无血清无抗生素的DMEM培养基500 μL，轻轻摇匀，室温静置5 min。②Solution B：取18 μL的Lipofectamine 2000脂质体加入2.0 mL EP管内，加入无血清无抗生素的DMEM培养基1000 μL，轻轻摇匀，室温静置5 min。③将Solution B分别等量地加入Solution A中，轻柔混匀，室温静置30 min。转染细胞：①转染前1 d，用无抗生素含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，调整BRL细胞浓度为2×105个/mL接种于6孔板中培养，每孔5 mL，以保证细胞在转染时细胞融合度达到50%～80%。②24 h后，观察6孔板的细胞状态，当细胞铺满至80%时即可进行转染。③将细胞分为空白对照孔、阴性对照孔、质粒转染孔，每孔去掉含血清的DMEM，用PBS轻柔洗涤以彻底去除血清，加入1 mL无血清DMEM，放置37℃的CO2培养箱孵育。④空白对照孔加入1000 μL无血清的DMEM，阴性对照孔加入脂质体与阴性质粒混合液1000 μL，质粒转染孔加入脂质体与目的质粒混合液1000 μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养基充分混匀，置37℃ 5% CO2培养箱孵育5 h后弃去细胞培养板的上清液，加入PBS清洗2次，再加入含10%胎牛血清的DMEM继续培养，转染后6、12、24 h于倒置显微镜下观察细胞生长情况，转换荧光光源，观察绿色荧光蛋白（GFP）所发出的绿色荧光，计数荧光细胞数。
2 结果
如图1～3所示（封三），转染6、12、24 h后在荧光倒置显微镜下观察细胞状态，可见因为pGPH1/GFP/Neo质粒本身带有GFP，BRL细胞均有不同数量的绿色荧光， 且随时间增长，荧光数量呈正比例增长，说明转染质粒在BRL细胞中有明显表达。
3 讨论
基因转染技术在研究基因的结构和功能中是不可缺少的，正在兴起的基因治疗也是因为基因转染技术的发展而步入实用阶段。目前常用的RNA干扰方法是化学合成siRNA片段，构建病毒载体以及shRNA的真核表达载体。化学合成siRNA的缺点是价格较贵，效率只有转录合成shRNA的1/10～1/40，基因抑制持续时间较短，对细胞毒性较大，转染效率较低，合成工艺上也存在不可弥补的缺陷。病毒载体的主要缺点是价格较高，耗费时间比较长，不适用于大量筛选siRNA序列，对实验条件要求较高[5-6]。本实验选择构建shRNA的真核表达载体，是因为该实验方法经济易操作，且质粒载体能够在细胞中表达shRNA，是一种干扰RNA的良好方式，与化学合成siRNA的作用一致，相比较而言，持续时间更长，费用更低，是作为筛选有效基因干扰片段的常用方法。
有效的shRNA序列设计是RNA干扰实验中重要的一步。在本实验中成功地构建了特异性针对HP450基因的shRNA真核表达载体，为后续试验RNA干扰研究HP450基因表达对BRL细胞的影响奠定了基础。本研究选用Lipofectamin2000为转染试剂，按其推荐使用量操作，变换质粒的用量，调整质粒与脂质体的比例，将质粒成功地转入了BRL细胞，未见到明显的毒性反应，细胞生长良好，荧光倒置显微镜下观察见BRL能成功表达GFP。本实验采用Lipofectamin2000阳离子脂质体法进行转染，这是目前最常用也是比较高效的方法。转染过程中，细胞密度和生长状态、质粒的纯度、质粒与脂质体的比例等均是影响转染效率的重要因素。对数生长期的细胞生理活动旺盛，细胞内的各种酶类等复制和表达比较充分，可以方便地被外源基因利用，从而利于外源基因的表达。磷酸钙、脂质体等均可介导外源基因转入细胞，其中脂质体是目前比较理想的转染用载体，已广泛应用于基因转染等实验研究中[7-8]。脂质体与质粒载体的用量比例对转染效率有重要影响，质粒载体的用量越多，转染入细胞的载体可能就越多，这就需要有更多的脂质体将其包裹。但由于脂质体本身的毒性，加大用量又会增加对细胞的损伤。所以，对不同的细胞，脂质体与质粒之间应该使用不同的且合适的用量比例。根据脂质体说明书的用量范围，本实验经过多次探索观察，调整质粒与脂质体的剂量比例以8∶9（μL）为最佳条件，在此剂量下，脂质体对细胞的毒性较小，质粒转染率也较高。此外，转染温度、时间、脂质体的种类、DNA的量等对转染均有影响。
为了达到较高效率的转染，在转染实验的探索过程中，总结出以下几点：①避免RNA酶的污染。微量的RNA酶则可导致实验的失败，由于实验环境中RNA酶广泛存在，如皮肤、头发、所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，保证每个实验步骤不受该酶的污染是非常重要的。②状态良好的细胞和严格的操作。只有状态良好的细胞才能保证转染的高效率，细胞状态欠佳，后续的实验都是徒劳。此外，较少的传代数能确保实验所用细胞的稳定性，一般而言，20代以下的细胞转染率也较高。③避免使用抗生素和血清。转染期间要避免使用抗生素，抗生素会在穿透的细胞中积累毒素，此外，在脂质体和细胞相互作用过程中，血清的存在可能会显著减少脂质体的结合。④选择合适的转染试剂。针对靶细胞类型的不同，选择合适的转染试剂和优化的操作对转染实验的成功至关重要[9]。⑤实验所用的细胞最好选择在70%～80%的融合度为佳，细胞太少转染效率低，太多则容易导致细胞间接抑制而影响细胞DNA合成。⑥不同的受体细胞对所需的质粒最佳剂量不同。质粒对细胞也有明显的毒性，可影响细胞的生长，本研究按0.5 μg/μL的浓度加入质粒至6孔板中的细胞，观察结果显示，以4.0 μg（即8 μL）的质粒剂量最为合适，死细胞的出现较少，且转染率较高。⑦一般来说，转染效率随着脂质体作用时间的延长而提高，但由于质粒DNA对细胞生长有影响，因而与细胞的作用时间需要进行控制，孵育时间太短转染效率偏低，过长则影响细胞的活性[10]。经过比较，笔者认为5 h较为合适。
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（收稿日期：2013-06-17 本文编辑：程 铭）