人参皂苷Rg1诱导人白血病K562细胞株衰老的实验研究
［摘要］ 目的：观察人参皂苷Rg1（Rg1）诱导人白血病K562细胞株衰老的作用及其机制。方法：MTT比色法检测Rg1对K562细胞增殖的影响，筛选最佳作用浓度及时间（20 μmol·L-1，48 h）。流式细胞术检测Rg1对细胞周期的影响；SAβGal染色检测细胞阳性染色百分率；RTPCR法检测衰老相关基因p16，p53，p21，Rb的表达；电镜观察细胞衰老超微形态学改变。结果：Rg1在体外能明显抑制K562细胞增殖，使细胞阻滞于G2/M期；SAβGal染色阳性细胞百分率显著增高（P＜0.05）；细胞衰老相关基因的表达上调（P＜0.05）；超微结构观察显示细胞增大，异染色质凝集、碎裂，线粒体体积增大，溶酶体体积增大、数目增多等衰老形态学变化。结论：Rg1能诱导K562细胞衰老，p53p21Rb，p16Rb信号转导通路在其衰老调控中起重要作用。
［关键词］ 人参皂苷Rg1；白血病；K562细胞株；细胞衰老
生物学及其相关机制，旨在为天然药物有效成分促进肿瘤细胞的衰老提供实验依据，为白血病等肿瘤的治疗提供新的思路和方法。
1 材料
K562细胞株由重庆医科大学检验医学院惠赠。人参皂苷Rg1购自吉林宏久有限公司（纯度98.6%），用RPMI1640培养液配制成1 g·L-1的溶液，过滤除菌。RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。MTT比色实验相关试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。衰老相关β半乳糖苷酶（SAβGal）染色试剂盒购自美国Cell Signaling公司。RTPCR相关试剂购自TAKARA公司，引物由上海Sangon公司合成。
2 方法
2.1 细胞培养 将K562细胞株接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养体系中，置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中培养，每2 d更新细胞培养液并传代。
2.2 MTT比色实验 取对数生长期的K562细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×108个/L，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，以每孔200 μL接种于96孔板，设立只有培养液而无细胞的空白对照组，用于比色时调零。以终浓度为0（对照组），5，10，20，40，80 μmol·L-1的人参皂苷Rg1作用于K562细胞，每组设立4个复孔，分别作用24，48，72 h，570 nm波长进行呈色和比色，酶联免疫检测仪测定各孔A。细胞增殖抑制率=1-（A实验组/A对照组）。
2.3 细胞周期分析 实验组选用终浓度为20 μmol·L-1人参皂苷Rg1作用48 h的K562细胞，对照组常规培养48 h。分别收集2组细胞，70%乙醇固定。PI 染色30 min，FACS Vantage SE 流式细胞仪（Becton Dickinson， USA）检测碘化丙啶荧光强度，Cell Quest Pro分析细胞周期变化。
2.4 SAβGal染色分析 分别收集对照组及实验组（20 μmol·L-1人参皂苷Rg1，作用48 h）的K562细胞1×106个，洗涤2次，固定细胞15 min；再洗涤3次，加染色液1 mL，37 ℃，隔绝CO2染色过夜。洗涤后离心涂片，使每玻片的细胞数为1×104个，中性树胶封片镜检。每张涂片随机计数400个细胞并计算阳性细胞百分率。
2.5 RTPCR检测p53，p21，p16，Rb基因的表达 取对照组和实验组细胞用RNA抽提试剂盒提取总RNA，质量检测后用于RTPCR。取1 μg RNA 样本在20 μL反应体系中进行逆转录反应。取2 μL cDNA，上下游引物（10 nmol·L-1）2 μL，Taq酶0.25 μL于50 μL体系中进行PCR反应，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共30个循环。取5 μL PCR产物与含1.5%溴乙啶的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统照相并分析灰度值，不同扩增产物与内参的比值进行半定量分析。引物设计如下：p53 上游引物5′TTTGAGGTGCGTGTTTGTGC3′，下游引物5′ACTTCAGGTGGCTGGAGTGAG3′，扩增片段为304 bp；p21 上游引物5′CCCGTGAGCGATGGAACTT3′，下游引物5′GAAATCTGTCATGCTGGTCTGC3′，扩增片段为317 bp；p16 上游引物5′CAACGCACCGAATAGTTACG3′，下游引物5′GGGATGTCTGAGGGACCTTC3′，扩增片段为351 bp；Rb 上游引物5′CTTTGTGAACGCCTTCTGTCTG3′，下游引物5′TTCGAGGAATGTGAGGTATTGG3′，扩增片段为370 bp；βactin上游引物5′TGACGTGGACATCCGCAAAG3′，下游引物5′CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3′，扩增片段为205 bp。
2.6 超微结构观察 取实验组、对照组细胞1×105个，4 ℃条件下2.5%戊二醛先固定细胞6 h，1%四氧化锇后固定2 h，乙醇逐级脱水、树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和硝酸铅电子染色，H600型透射电镜观察并照相。
2.7 统计学分析 用SPSS 14.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 人参皂苷Rg1对K562细胞的增殖抑制作用 人参皂苷Rg1在一定浓度范围内（0～20 μmol·L-1）对K562细胞的体外增殖有显著抑制作用。并与药物作用时间和浓度梯度呈正相关，以20 μmol·L-1终浓度干预48 h时表现出最大增殖抑制率（图1）。
3.2 人参皂苷Rg1对K562细胞周期分布的影响 与对照组相比，实验组细胞（20 μmol·L-1人参皂苷Rg1）24 h后细胞明显阻滞于G2/M期，人参皂苷Rg1处理24，48，72 h后S期细胞百分率基本恒定。实验组G2/M期细胞百分率相对于对照组明显增高（P＜0.05，图2）。
3.3 参皂苷Rg1对K562细胞SAβGal染色的影响 与对照组相比，20 μmol·L-1人参皂苷Rg1作用K562细胞48 h， SAβGal染色阳性率显著增加，提示实验组细胞呈现明显衰老改变，2组差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。
3.4 人参皂苷Rg1对K562细胞衰老相关基因表达的影响 提取2组细胞总RNA，逆转录后的衰老相关基因p53，p21，p16，Rb及内参βactin的PCR扩增，将各产物与对应内参灰度的比值进行半定量分析，结果表明，实验组衰老相关基因表达增强（P＜0.05，图4）。
3.5 人参皂苷Rg1对K562细胞超微形态学的影响 实验组细胞超微结构呈现染色质凝集、碎裂、核膜内陷、核内包含物形成；线粒体体积增大；溶酶体体积增大，数目增多，异染色质聚集等衰老表现（图5）。
4 讨论
近年来研究证实，衰老并非正常细胞所独有的生物学特征，肿瘤细胞也可经药物诱导而呈现衰老改变。衰老的肿瘤细胞高度增殖、转移等特性也随之衰减，衰老的肿瘤细胞所出现的细胞周期阻滞也为周期特异性化疗药提供了可乘之机。以往的研究热点是诱导肿瘤细胞凋亡，或自噬体介导的细胞器降解所致的细胞死亡[6]，然而低剂量化疗对凋亡的诱导绝非易事，若提高剂量则药物不良反应也随之增加，鉴于此，寻找毒副作用小的药物诱导肿瘤细胞衰老，或将为肿瘤的治疗打开一扇新的窗口。
人参是祖国医学“补气”要药，现代研究证实，人参及其有效成分对血细胞增殖与分化有明确的调控作用。本课题组研究发现，人参皂苷Rg1能有效延缓造血干细胞衰老，这为人参“补气生血”的理论提供了现代分子生物学的依据。祖国医学还认为人参具有“攻补兼施”的双向调节作用，那么人参皂苷Rg1能否促进白血病细胞衰老？如果能证明人参皂苷Rg1能诱导白血病细胞衰老，就能很好诠释人参的双向调节作用。本研究发现，人参皂苷Rg1在一定浓度范围内（0～20 μmol·L-1）对K562细胞的体外增殖有显著抑制作用，以终浓度20 μmol·L-1作用48 h为最佳。周期阻滞是细胞衰老的重要表现，通过流式细胞术检测细胞周期分布发现，人参皂苷Rg1能有效促进K562细胞呈现G2/M期阻滞。SAβGal染色实验是经典和公认评价细胞衰老的关键生物标记[7]，当pH为6时SAβGal表达仍然增强，则说明细胞进入衰老状态，本实验观察到人参皂苷Rg1作用K562细胞后SAβGal染色阳性率显著增加，提示人参皂苷Rg1有调控白血病细胞衰老的作用。p53p21是一条重要的细胞衰老相关通路，p53能在转录水平激活p21的表达，主要介导端粒依赖的复制性衰老和（或）多种应激诱导的如DNA损伤所致的衰老，p21能结合多种cyclinCDK复合物从而抑制其活性，所以在调控G1期和G2/M期阻滞中扮演重要角色[89]。另一条细胞衰老相关信号转导通路是p16Rb，该通路则介导多种形式的非基因毒性应激，诸如染色质重构诱发的细胞衰老[10]。2条衰老相关信号转导通路共同归结于Rb基因，后者是细胞周期调节因子，其主要调控细胞G0和G1期过渡到S期的过程[11]。研究还发现，人参皂苷Rg1作用K562细胞后衰老相关基因p53，p21，p16，Rb表达高于对照组，初步表明人参皂苷Rg1激活了衰老相关信号转导通路。超微结构改变如染色质凝集、碎裂、核膜内陷、核内包含物形成；线粒体体积增大；溶酶体增大，数目增加，异染色质的聚集[12]等改变同样支持Rg1可诱导K562细胞进入衰老状态。
综上所述，本研究结果提示，人参皂苷Rg1能诱导人白血病K562细胞株呈现衰老改变，这可能与人参皂苷Rg1激活细胞衰老相关信号转导通路有关。结合课题组前期研究，笔者认为这可能是人参“攻补兼施”的双向调节作用机制之一。对于白血病的临床治疗也可以考虑“先致老，后致死” 的新策略。另外，衰老改变也给其他化疗药物提供了新的作用靶点。
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