HMGB1介导NF—kB通路促进多囊卵巢综合征胰岛素抵抗细胞模型的凋亡
〔摘要〕 目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）对胰岛素抵抗的大鼠卵巢颗粒细胞IkB/NF-kB信号通路的影响。方法 体外培养正常大鼠卵巢颗粒细胞，设对照组、不同浓度胰岛素干预组，不同浓度HMGB1干预组，胰岛素抵抗+si-HMGB1干预组等，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定葡萄糖、HMGB1、雄激素、TNF-α、磷酸化NF-kB p65的含量；免疫印迹检测IkBa、pIkBa、Caspase3和Cleaved Caspase3的蛋白表达。结果 与对照组比较，胰岛素过高导致大鼠卵巢细胞的葡萄糖含量明显降低（P<0.05）；雄激素及相关炎症因子HMGB1、TNF-α明显升高（P<0.01），并激活转录因子NF-kB p65并使其磷酸化程度明显升高 （P<0.05）。随着HMGB1浓度升高，雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表達量较对照组均明显升高（P<0.05 or P<0.01）；而当胰岛素抵抗的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子，则发现胰岛素抵抗带来的副作用得到缓解，较胰岛素抵抗对照组雄激素、Cleaved Caspase3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量均显著性下降（P<0.05 or P<0.01）。结论 HMGB1在多囊卵巢综合征（PCOS）胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞模型中促使炎症因子升高，可能介导了NF-kB信号通路的激活，促进胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞凋亡，参与了PCOS的发病。
〔关键词〕 高迁移率族蛋白1；多囊卵巢综合征；胰岛素抵抗；卵巢颗粒细胞
〔中图分类号〕R711.35 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.004
〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of HMGB1 on IkB/NF-KB signaling pathway in ovarian granulosa cells of rats with insulin resistant. Methods The ovarian granulosa cells in vitro were cultured， and the control group， different concentrations of insulin intervention groups， different concentrations of HMGB1 intervention groups and insulin resistance+si-HMGB1 group and others were designed. The levels of glucose， HMGB1， androgen， TNF-α and phosphorylated NF-kB p65 were determined by enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. The concentrations of IkBa， pIkBa， Caspase3 and Cleaved Casepase3 were detected by Western blotting. Results Compared with the control group， high insulin significantly decreased the glucose of rats （P<0.05）， increased the androgen， HMGB1 and TNF-α （P<0.01） in ovarian granulosa cells， and then activated transcription factor NF-kB p65， significantly increased phosphorylated NF-kB p65（P<0.05）. Androgen， phosphorylated IKBa， phosphorylated NF-kB p65 and TNF-a increased significantly with the increase of HMGB1 （P<0.05 or P<0.01）. When adding HMGB1 interference small molecules into the ovarian granulosa cells， side effects induced by insulin resistance relieved， and the expression of androgen， Cleaved caspase 3， TNF-α， phosphorylated IkBa and phosphorylated NNF-kB p65（P<0.05 or P<0.01） were significantly lower than the control group. Conclusion HMGB1 could promote the increase of inflammatory factors in the PCOS insulin resistance ovarian granulosa cell model. HMGB1 may mediate the NF-kB signaling pathway， promote the cell apoptosis in insulin resistance ovarian granulosa cells， also involve in the pathogenesis of PCOS.
〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome； high mobility group protein 1； insulin resistance； ovarian granulosa cells
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是病因尚不明确的异质性、进行性、难治性的妇科内分泌疾病。其临床表现以高雄激素血症为普遍特征，涉及月经失调、不孕、肥胖、多毛、痤疮等诸多方面[1]。此外，PCOS还通常伴有或引发多种并发症，如，胰岛素抵抗，子宫内膜癌、高血压、代谢性综合症以及心血管系统疾病[2-3]。西医认为卵巢颗粒细胞凋亡与PCOS排卵障碍具有密切关系[4-5]。最近研究发现，高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein， HMGB1） 介导了胰岛素抵抗（insulin resistant，IR）诱导的卵巢颗粒细胞凋亡[6]。本文旨在研究体外PCOS模型中HMGB1促进胰岛素抵抗诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的相关通路及其具体作用机制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0003），SPF级，鼠龄3～4周，体质量50～100 g。室温18～20 ℃，湿度为65%～70%，自由进食饮水。
1.1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基（GIBCO 公司），孕马血清促性腺激素（宁波第二激素厂产品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。合成的si-HMGB1（货号：1027280）购自德国QIAGEN公司。青霉素、链霉素，HMGB1试剂（H4652-1MG），葡萄糖含量检测试剂盒（Lot#SLBH0679V），雄激素（12850）购自美国Sigma公司。pNF-kBp65检测试剂盒（ab176647），TNF-α检测试剂盒（ab46070），HMGB1抗体（ab79823），IkBa抗体（ab32518）购自英国ABCAM公司。pIkBa抗体（#5209），Caspase3抗体（#9662P），Cleaved Caspase3抗体（#9661S）购自美国CST公司。辣根过氧化酶标记的二抗（A0208，A0216）购自碧云天公司。
1.1.3 主要仪器 MK3型酶标仪（美国Thermo公司），Autoblotsystem 20型全自动蛋白印迹仪（新加坡Genelabs公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠卵巢颗粒细胞的原代分离 SD大鼠（10只）腹腔注射PMSG（8～10 U）48 h后腹腔麻醉，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用PBS缓冲液清洗3次，在体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜，用1 mL注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入1 g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，用孔径为200目筛网过滤，1 000 r/min离心5 min。弃上清，用PBS缓冲液清洗3次，加入基础培养液（DMEN/F12培养基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+0.5 μg/mL两性霉素2B+体积分数10%FBS）重悬，而后计数，鉴定，活力测定。
1.2.2 多囊卵巢综合征细胞模型的建立[6]及分组 分离获得的大鼠卵巢颗粒细胞原代培养5 d后，传代培养至60%时，加葡萄糖（glucose）和胰岛素（insulin）处理48 h，收集细胞用于下一步实验。体外培养大鼠卵巢颗粒细胞的IR模型，分组设置分别为对照组（+glucose4.5 g/L，-insulin），IR0.1 ？滋mol/L组（+glucose4.5 g/L，+insulin0.1 ？滋mol/L），IR0.5 ？滋mol/L组（+glucose4.5 g/L，+insulin0.5 ？滋mol/L），IR1.0 ？滋mol/L组（+glucose4.5 g/L，+insulin1.0 ？滋mol/L）。
体外检测不同浓度HMGB1刺激对卵巢颗粒细胞的影响，设置分组为对照组，HMGB1低浓度组（10 ng/mL），HMGB1中浓度组（60 ng/mL），HMGB1高浓度组（150 ng/mL）。
检测IR的卵巢颗粒细胞通过HMGB1介导炎性及凋亡效应，设置分组为：IR（-）+Si-HMGB1（-）组，IR（-）+Si-HMGB1（50 nmol/L）组，IR（1.0 ？滋mol/L）+Si-HMGB1（-）组，IR（1.0 ？滋mol/L）+Si-HMGB1（50 nmol/L）组。
1.2.3 ELISA法测定葡萄糖、HMGB1、雄激素（androgen）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）p65的含量 将样品上样至96孔板，室温孵育1～2 h，PBS洗板，加一抗，室温孵育2 h，PBS洗板，加二抗，室温孵育1 h，加显色液，450 nm波长读值并计算。不同试剂盒按说明节操作。
1.2.4 Western blot检测IkBa、pIkBa、Caspase3和Cleaved Casepase3的蛋白表达 不同细胞分组后处理48 h，收集细胞，RIPA裂解液裂解，提取总蛋白，测定总蛋白浓度。并取等量蛋白上样，电转膜后，脱脂奶粉室温封闭1 h，加对应一抗（详见试剂，1∶1 000-1∶5 000稀释），室温孵育3 h，TBST清洗，加相应二抗（详见试剂，1∶1 000-1∶2 000稀释）室温孵育45 min到1 h，ECL发光试剂盒显色，扫描并统计分析灰度值。
1.3 统计学分析
用SPSS l7.0统计软件分析数据，数据分析为差异统计学，以标准差“x±s”表示，各组间比较用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05代表差异具有统计学意义，P<0.01代表差异具有显著统计学意义。
2 结果
2.1 卵巢颗粒细胞的原代分离及培养
大鼠原代卵巢细胞分离后，刚开始接种时颗粒细胞呈球形，10 h 后贴壁生长，培养24 h后，形态不规则，呈多角形或梭形（图1∶5 d）。培养10 d时可铺满皿底，形成单层的颗粒细胞（图1∶10 d）。部分颗粒细胞还出现聚集生长的特征，形成胚胎干细胞样集落。图1显示大鼠卵巢颗粒细胞的原代分离比较成功。
2.2 PCOS卵巢颗粒细胞模型的构建
胰岛素对卵巢颗粒细胞的影响，加入不同浓度的胰岛素培养48 h后，收集并裂解细胞，检测其细胞因子发现高浓度胰岛素处理细胞后，会导致PCOS特征性因素葡萄糖相比未加胰岛素对照组明显降低（P<0.05），雄激素较对照组明显升高（P<0.01）；同时相关炎症因子HMGB1、TNF-α较对照组明显升高（P<0.01），并激活转录因子NF-kB p65使其磷酸化程度较对照组明顯升高（P<0.05）。由此可见，HMGB1，TNF-α和NF-kB均被胰岛素正向调控，呈现表达量明显上升。显示本实验建立的PCOS细胞模型相对有代表性[6]，且胰岛素过高造成的IR可能与炎症反应及NF-kB通路直接相关。见图2。
2.3 HMGB1介导p-IkBa 和TNF-α表达升高
随着HMGB1浓度升高，雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表达量都较对照组明显升高（P<0.05 or P<0.01）。见图3。
2.4 在PCOS卵巢颗粒细胞模型中HMGB1通过TNF-α/NF-kB通路促进细胞凋亡
当IR的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子，则发现IR带来的炎症现象得到有效缓解。与IR对照组相比，雄激素、Cleaved Caspase-3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量都发生了显著性下降（P<0.05 or P<0.01），更加确定了HMGB1在此过程中起重要作用。见图4。
3 讨论
50%～90%的PCOS患者存在IR、高胰岛素血症，使得其发生代谢综合征、II型糖尿病、心血管疾病的风险较普通人群增加5～10倍[1]。深入探索PCOS患者高雄激素水平与糖脂代谢失衡之间的关系，对该疾病的风险预测及早期干预治疗具有重要意义。
有研究表明PCOS患者中炎症因子水平升高，在其发生发展的过程中存在低度慢性炎症[6]。目前发现和PCOS密切相关的有c反应蛋白（c-reactive protein，CRP）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α、NF-kB等慢性炎症因子的异常[7-8]。其中TNF-α是一种非糖化蛋白[8-10]，由多种炎症细胞合成和分泌，可通过多种机制调节组织释放TNF-α，而TNF-α可以通过多种作用机制影响胰岛素的敏感性，是重要的IR介质：它可以减少胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号向IRS-1的传导[11-12]；下调多种脂肪细胞中多种细胞分子和蛋白表达，导致IR。研究发现，PCOS患者TNF-α水平显著高于正常人群[4]，且肥胖者升高更明显[13]。
TNF-α能够诱导NF-kB结合雄激素受体启动子，使其活性增加，降低颗粒细胞芳香酶活性，使得雄性激素转化成雌激素减少，引起高雄激素血症[14]。NF-kB的激活使得炎症因子表达增多，IR水平加重，雄激素水平升高，诱导PCOS的产生。而NF-kB通路中最关键的上游因子即为HMGB1。
HMGB1是较新发现的一种炎性细胞因子，普遍存在于大多数的哺乳动物细胞的细胞核中，参与细胞核内多种生物学功能[15]。胞外的HMGB1能够通过不同的受体途径影响NF-kB的活性，发挥不同的生物学效应。除此以外，大量的研究证实，HMGB1与其受体相互作用，通过激活NF-kB等信号通路，介导了如IR等许多病理过程的发生[14-15]。
在本研究中发现IR的卵巢颗粒模型细胞中HMGB1水平较正常对照组表达明显增加。而当IR的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子，则发现IR带来的副作用得到缓解。较IR对照组而言，雄激素明显下降以及凋亡明显降低（Cleaved Caspase3），建议可作为PCOS治疗的靶点。TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量较对照组显著性下降，提示PCOS与炎症反应相关，并经HMGB1参与NF-kB通道，该机制可能参与了PCOS的发病。
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