耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的IMP—4耐药基因LAMP检测
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环介导恒温扩增法（Loop-mediated Isothcrmal Amplifieation，LAMP）属于恒温扩增法中的一种，2000年由日本科学家Notomi等[5]提出，可以体外扩增并检测目标基因。反应原理是DNA遵循严格的碱基配对，所以针对目的基因的6个序列区域设计4条特异性引物（2条内引物、2条外引物）来检测目的基因的存在与否。本研究通过设计了一套特异性IMP-4基因的LAMP引物，测定我院肺炎克雷伯菌的IMP-4基因分布情况。包括细菌DNA提取、LAMP反应体系、LAMP反应产物凝胶电泳分析获得结果，整个过程仅需2 h左右。相比传统的细菌培养药敏结果2～3 d出具结果，有明显的优势，并且進行LAMP反应不需要对致病菌进行增菌养殖，在反应第一步就杀灭了致病菌，提取出DNA，生物安全更有保障；相比PCR方法，LAMP不需要专门的核酸扩增仪器，反应过程恒温，减少了PCR升温、降温过程对DNA的损耗，而LAMP与PCR一样，遵循严格的碱基配对，对检验标本可以不提纯致病菌而直接处理提取DNA进行检测，其特异性和敏感度都得到多个试验的验证[6-7]，在敏感度方面甚至优于PCR。但是LAMP反应检测的DNA片段不宜过长，一般在500 bp以下，反应产物不能进一步测序分析是它的劣势。
CRKP组与非耐药组在年龄和抗生素使用上的区别有统计学意义（P<0.05），提示耐药菌株可能与患者的年龄、抗生素使用史有关，与文献[8]报道一致。在患者性别、标本类型等方面比较差异无统计学意义（P>0.05）。分析患者年龄大，机体免疫力差，且多合有其他基础疾病，多次医院就诊的概率高，可能导致CRKP感染率高。抗生素使用若不能选择敏感的抗生素，无法有效杀灭致病菌，反而容易导致耐药株的出现，肺炎克雷伯菌可以通过整合子传递耐药基因、外排泵上调、细胞膜改变等方式，产生耐药性[9]。所以在临床感染性疾病治疗方案中，若能在用药前，及早得到细菌药物敏感性报告，对于合理选择有效的抗菌药物、避免耐药菌产生有重要意义。
本试验肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类抗生素耐药率为15.7%，比全国统计的碳青酶烯类抗生素耐药率7.6%高，比上海29.1%低。原因可能与地区和医生抗生素使用习惯不同有关。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制包括：（1）产碳青霉烯酶水解解抗生素；（2）细胞外膜蛋白缺失使抗生素无结合位点；（3）外排泵将抗生素泵出；（4）形成生物膜增强抗药力等，其中产碳青霉烯酶是关键的耐药机制[10]。碳青霉烯酶分为A、B、D三种，A类包括KPC、NMC-A、SME、GES、IMI、SFC-l等；B类为金属β-内酰胺酶（MBLs），该酶活性需要金属离子Zn2+的辅助，所以又叫金属酶，包括IMP、NDM、TMB、VIM、SPM、FIM、GIM、SIM、DIM、AIM、SMB等，是肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶的主要类型，所以本研究主要测定IMP-4基因分布情况；D类对碳青霉稀类水解能力较弱，包括OXA-40、0XA-23-27、OXA-48、0XA-55、OXA-50-51OXA-60、OXA-62O、XA-58等。肺炎克雷伯菌多重耐药株的流行，与产碳青霉烯酶耐药基因的转移特点有关：肺炎克雷伯菌大多产可转移的获得性金属酶，该基因可位于质粒或染色体上，通常出现在整合子中，以接合方式进行转移，这种转移方式高效、快速，并且在抗生素选择压力下，可以出现基因位点的突变，导致耐药性增强。
本研究中CRKP组38株利用LAMP法检测出IMP-4基因结果检出23株IMP-4基因阳性，阳性率为60.5%，较张芳芳等[11]报告阳性率高，但是较白永凤等[12]报告阳性率低。KP组IMP-4阳性率为7.14%，与试验组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明该项指标可以较好的预测细菌耐药情况。产碳青霉烯酶类的肺炎克雷伯菌可以包含有多个耐药基因型，若同时检测多个耐药基因型，可以更好的与耐药表型符合，未来我们会进一步开发其他类型的耐药基因LAMP检测，通过测定一个细菌的多个耐药基因，更好的符合细菌药敏表型，准确指导临床用药。非耐药组也可以检出IMP-4耐药基因，分析该基因可能确实存在于敏感菌株中。但细菌的耐药性由于细菌活力差、周围理化环境不适宜、人工操作误差等原因，都可能使得有耐药基因的细菌被抗生素杀灭，表现为对抗生素敏感。
本研究认为肺炎克雷伯菌感染大多发生于医院内，临床患者年龄大、有抗生素使用病史是感染耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的危险因素，研究建立的IMP-4 基因LAMP检测方法有助于初步判断肺炎克雷伯菌是否对碳青酶烯类抗生素耐药，IMP-4基因在细菌耐药表型阳性和阴性菌中都可能出现，但是两者存在显著性差异。通过快速测定IMP-4基因存在与否，可以尽早指导临床抗生素使用。
参考文献
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（收稿日期：2017-01-27）