含PTD结构域的MAGE—A3融合蛋白表达、纯化及生物学功能的初步研究
【摘要】
【目的】构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域TAT的黑色素瘤相关基因MAGE-A3融合蛋白TAT-MAGE-A3-EGFP，并观察其生物学功能，
【方法】1）构建质粒pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、对照组pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP原核表达载体，在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，经SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定并通过Ni+柱纯化获得TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP、TAT-EGFP三种融合蛋白；2）动态荧光显微镜观察MAGE-A3、TAT-MAGE-A3-EGFP、TAT-EGFP三种融合蛋白在细胞中的不同分布，流式细胞术观察三种融合蛋白穿膜效率的差异。
【结果】1）成功构建了pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP原核表达载体，并获得了TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP和TAT-EGFP融合蛋白。2）动态荧光显微镜和流式细胞术显示TAT-MAGE-A3-EGFP与MAGE-A3-EGFP相比能更高效地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核，且与TAT-EGFP相比穿膜效率区别不大。
【结论】TAT-MAGE-A3-EGFP融合蛋白可在原核表达系统中高效表达，并具有高效穿透细胞膜能力，且带有PTD结构的融合蛋白穿膜能力与分子量无直接关系。
【关键词】蛋白质转导结构域；树突状细胞；MAGE-A3基因；肿瘤疫苗；
【中图分类号】R722.12
【文献标识码】B
【文章编号】1004-4949（2014）12-0006-01
目前肿瘤治疗手段仍无实质性突破，所以人们力图寻找更为稳妥有效的治疗对策，其中以已知肿瘤特异性抗原为基础的免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的研究热点之一。将黑色素瘤特异性抗原MAGE抗原作为肿瘤的特异性标志，在肿瘤的检测和免疫治疗方面具有很大的应用潜力[1]。蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）中的人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活蛋白TAT是近年来新兴的一种大分子运载工具，能够以不依赖受体介导的方式穿过细胞膜进入细胞，而不影响细胞的正常结构和功能。所以本文旨在利用TAT工具与肿瘤特异性抗原MAGE制成融合蛋白观察其跨膜能力，为提高抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APC）负载肿瘤抗原，研制相关肿瘤疫苗打下基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 试剂：重组质粒pEGFP-MAGE-A3由福建医科大学病理系张文敏教授惠赠。TOPO-TA Cloning试剂盒为美国Invitrogen公司产品。DNA重组所用试剂及限制性内切酶NheΙ、XhoΙ和EcoRΙ、BamH I 均购自美国NEB公司 。公司小鼠抗人MAGE-A3单克隆抗体为美国ProteintechTM公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（兔抗鼠 ）购自Cell Signaling TechnologyTM公司。质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒均为美国OMEGA公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）为美国Sigma公司产品。Ni+-NTA柱子购自德国QIAGEN公司。其他试剂均购自上海生工生物工程技术有限公司。
1.1.2 引物设计及合成：人工合成的TAT-PTD编码序列TATGGTCGTAAGAAACGCAGACAACGTAGACGG（上海生工生物工程技术有限公司合成）并以pEGFP-MAGE-A3质粒为模板设计两对引物采用两步拼接法进行PCR反应，特异性扩增TAT-MAGE-A3片段。分别为上游引物A：5’- CGCAGACAACGTAGACGGATGCCTCTT-3’；上游引物B：5’- TAGCAGGCTAGC TATGGTCGTAAGAAA-3’ （划线部分为NheI酶切位点）；下游引物C：5’-TCAGCTCTCGAGTTACTTGTACAGCTC-3’ （划线部分为XhoI酶切位点）。以上斜体字部分均为TAT的人工合成序列。
2 方法
2.1 pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP，及对照组 pET28a-TAT-EGFP和pET28a-MAGE-A3-EGFP重组载体构建：
以TAT-MAGE-A3片段为模板，相同方法分别PCR扩增MAGE-A3-EGFP和TAT–EGFP片段并纯化回收。NheI与XhoI分别双酶切各PCR片段及质粒pET28a（+），T4 DNA连接酶连接12h，转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α，筛选阳性克隆、测序。
2.2 TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP和TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及Western blot鉴定
测序正确的重组质粒pET28a（+）-Tat-MAGE-EGFP、pET28a（+）-MAGE-EGFP、pET28a（+）-Tat-EGFP转化E.coli BL21（DE3）。加入终浓度1.0mM的IPTG，其中pET28a（+）-Tat-MAGE-EGFP、pET28a（+）-MAGE-EGFP温度22℃，200rpm，20h，pET28a（+）-Tat-EGFP质粒37℃，200rpm诱导表达5h。收集绿色菌体并分别取少量上清液以及沉淀与上样缓冲液混合后煮沸5分钟，进行10%SDS-PAGE分析。
离心收集菌体，每克湿重用2-5ml结合缓冲液重悬细菌，加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶和Benzonase核酸酶冰上孵化30分钟，冰上超声波破碎50×5s，4℃，10000×g离心菌液20-30分钟，收集上清。利用融合蛋白上带有的组氨酸标签，用次氮基三乙酸镍琼脂糖（Ni+-NTA）进行亲和层析纯化，具体步骤参见操作手册。用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱融合蛋白，收集洗脱液进行10% SDS-PAGE 电泳分析。收集目的蛋白，过滤除菌后置-80℃保存。采用凝胶扫描法检测蛋白样品纯度。Western blot鉴定诱导产物超声破壁后分离的上清液和纯化的三种融合蛋白。
2.3 293T细胞的培养及融合蛋白的细胞穿膜效应的观察：：
293T细胞常规培养于37℃、5%的C02培养箱、加入10%FBS的 DMEM培养液，加入青、链霉素至终浓度为100 mg/L。收集培养至第4天的293T细胞 1×106cells/ml，2ml/孔，分别加入TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP和TAT-EGFP三组融合蛋白各50μg/ml，以及培养基DMEM共同孵育2h，利用尼康Ti-E动态显微观察系统，选择30分钟，90分钟，120分钟时间点连续观察融合蛋白的细胞跨膜情况。2h后PBS洗涤细胞，利用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。
3 结果
3.1 pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP原核表达载体的构建及鉴定
构建的pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP分别用NheⅠ和XhoⅠ和pET28a-TAT-EGFP质粒用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定，酶切产物小片段电泳后分别和TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP、TAT-EGFP大小在同一位置，见图2。质粒测序结果显示碱基序列正确，表明pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP三种重组质粒均构建成功。
A为重组质粒pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP；B为重组质粒pET28a-MAGE-A3-EGFP；C为重组质粒pET28a-TAT-EGFP；
A和B使用NheⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定；C使用BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定；
图1 三种重组质粒pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP的琼脂糖电泳图及酶切鉴定
3.2 TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP和TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及鉴定
pET28a-TAT-MAGE-A3-EGFP、pET28a-MAGE-A3-EGFP和pET28a-TAT-EGFP三种质粒分别转化大肠埃希菌BL21（DE3），经IPTG诱导后，均出现绿色菌体。在10%的SDS-PAGE图谱上分别出现TAT-MAGE-A3-EGFP和MAGE-A3-EGFP约为75KD左右、TAT-EGFP约为28KD相对分子质量的新条带，与预期相符。菌体经超声破碎后经Ni+-NTA柱纯化，500mM咪唑洗脱，纯化后产物的10%SDS-PAGE电泳泳显示，三种目的蛋白均纯化成功，见图3。诱导后的超声上清液与纯化的目的蛋白Western印迹分析表明，TAT-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP和TAT-EGFP蛋白均可得到正确表达和纯化。
3.3 三组融合蛋白细胞膜穿透作用的鉴定
动态荧光显微镜观察下，加入融合蛋白的三组细胞均逐渐的呈现荧光，证实带有PTD结构域的融合蛋白可以有效的穿透细胞膜进入细胞内部。2h后观察荧光蛋白表达量达到稳定状态。同时利用流式细胞仪检测各组蛋白在两小时后的荧光强度，观察各蛋白的跨膜效率。从结果中发现，未带有蛋白转导结构域的融合蛋白MAGE-EGFP的跨膜效率偏低，证实该蛋白不具备跨膜功能，而带有蛋白转导结构域的蛋白在效率上差别不是很大，甚至TAT-EGFP蛋白效率略高。
四、讨论
肿瘤当今的传统治疗手段并不能完全解决转移和复发，而免疫治疗通过肿瘤特异性抗原来诱导针对肿瘤进行杀伤的治疗方案，有望弥补目前治疗方法的不足。该方案具有特异性强，效果显著，对正常组织副作用小等优点，被认为是未来肿瘤治疗的优选模式。
故寻找肿瘤特异性抗原是肿瘤免疫治疗的关键。黑色素瘤相关基因MAGE家族自发现起就受到了极大的关注[2]，包括MAGE-A、B、C和D四种亚家族。本实验所用的MAGE-A3基因位于X染色体的q28区[3]，含有两小一大3个外显子，转录片段为945bp，是分子量为48KD的胞浆蛋白。由于MAGE是肿瘤特异性抗原，所以在正常组织中除了睾丸和胚胎外，均不表达。目前所了解的在MAGE-A3蛋白分子内，它至少有5个MHC I类分子限制性表位和6个MHC II类分子限制性表位[4]，可以相应的经MHC I类或II类分子递呈给CD8+或CD4+T细胞，促使机体产生针对肿瘤细胞的特异性免疫应答。因而 MAGE 抗原肽是一种肿瘤免疫治疗的理想靶分子。本研究先前获得含有MAGE-A3全长基因的原核表达载体[5]，并诱导表达出可溶性的MAGE-A3蛋白，为本实验打下一定基础。
那么如何能更高效的提高抗原呈递细胞负载肿瘤抗原效率是关键。正常情况下存在的膜生理屏障导致许多蛋白、多肽很难进入细胞内，而蛋白转导结构域是近年来人们发现的一种在蛋白转运过程中能高效穿过生物膜的结构域的小分子蛋白。它们可以不通过细胞受体介导，直接作用于磷脂双分子层，将生物大分子送入细胞内从而发挥生物学功能[6]。1988年Green[7]和Frankelt[8]首次报道了人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活蛋白Tat能够穿过培养的细胞膜进入细胞中，并且在细胞中的Tat蛋白的生理活性不变。HIV-Tat PTD可以携带较大的蛋白[9]，能够将15～200KD的多肽、蛋白质或DNA连接并高效快速地导入细胞和组织中，甚至可以通过血脑屏障，而细胞的正常结构和功能不受影响。Tat行使蛋白转导功能的最小结构单位是其47～57位氨基酸序列（YGRKKRRQRRR） [10]，是以本研究采用人工合成Tat-PTD的方式与MAGE蛋白的N端相连，希望利用该转导结构域能将该肿瘤抗原信息导入相应的APC细胞内。
本研究构建了pET28a-Tat-MAGE-A3-EGFP以及对照组pET28a-MAGE-A3-EGFP、pET28a-Tat-EGFP三种重组载体，并携带增强型绿色荧光蛋白EGFP作为荧光标记，表达并纯化相应的Tat-MAGE-A3-EGFP、MAGE-A3-EGFP、Tat -EGFP三种融合蛋白。同时，将培养293T细胞与相同浓度的三种融合蛋白共孵育2h，通过动态荧光显微镜在不同的时间点观察到Tat-MAGE-A3-EGFP、Tat –EGFP两种融合蛋白能在较短时间内进入细胞内部，具有较强的跨膜功能，而MAGE-A3-EGFP蛋白进入细胞缓慢，荧光只聚集在细胞膜周围。这些结果证实了带有Tat结构的融合蛋白具有跨膜能力，并且能够携带分子量略大的蛋白迅速进入。另外通过流式细胞仪检测三种融合蛋白的荧光强度可以观察到Tat-MAGE-A3-EGFP、Tat –EGFP两种蛋白的荧光强度比MAGE-A3-EGFP高将近三倍，但两者之间的荧光强度差别不大，甚至对照组Tat–EGFP略高。究其原因可能是由于Tat携带蛋白的分子量大小不同，使分子量较小的Tat –EGFP具有更强的跨膜能力。这些结果提示我们可以利用Tat蛋白工具携带肿瘤相关抗原进入APC细胞内，提高其抗原摄取能力，为其处理加工抗原后将明确的肿瘤信息传递给T细胞奠定基础，为研制肿瘤特异性抗原疫苗提供了新思路。
参考文献
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