葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究
摘要：【目的】明确葡萄霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响，为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础。【方法】将MrRPV1和白粉病抗性蛋白（MrRUN1）两个蛋白的LRR结构域互换，构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株，并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定。【结果】共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因（重组了MrRPV1蛋白LRR结构域）株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因（重组了MrRUN蛋白LRR结构域）株系。在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中，仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点，肉眼观察不到白色霜霉状物，但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性。在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中，RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性，有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死（PCD）；RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病。【结论】MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别，而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别。
关键词： 葡萄；霜霉病抗性蛋白（MrRPV1）；白粉病抗性蛋白（MrRUN1）；LRR结构域；抗病性
中图分类号： S663.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0202-09
Abstract：【Objective】The function of LRR domain of grape downy mildew resistance protein（MrRPV1） in downy mildew pathogen specific recognition was investigated in order to provide basis for studying the interaction mechanism between grape and downy mildew pathogen. 【Method】The LRR domains of MrRPV1 and powdery mildew resistance protein（MrRUN1） were switched and recombinant expression plasmids were constructed in this study. The recombinant expression plasmids were transformed into embryonic callus of Shiraz grape which was susceptible to downy mildew and powdery mildew so as to obtain transgenic plants. Disease resistance of the transgenic plants was identified by DNA and RNA molecular level detection and indoor inoculation test. 【Result】In total， seven RGA10-8LRR（recombination of LRR domains of MrRPV1） and six RGA8-10LRR（recombination of LRR domains of MrRUN1） positive transgenic lines were obtained. Among the seven RGA10-8LRR transgenic lines， only RGA10-8-13 line exhibited similar necrotic spots to MrRPV1 transgenic plant S8-1 with no visible downy mildew. Furthermore， all the seven RGA10-8LRR transgenic lines showed no significant powdery mildew resistance. Powdery mildew resistance was observed in two RGA8-10LRR transgenic lines， namely RGA8-10-3 and RGA8-10-28， with programmed cell necrosis（PCD） in 35% cells. All the six RGA8-10LRR transgenic lines showed no downy mildew resistance. 【Conclusion】LRR domain of MrRPV1 may play a role in specific recognition of grape downy mildew pathogen and LRR domain of MrRUN1 may play a role in specific recognition of powdery mildew pathogen.
Key words： grape； downy mildew resistance protein（MrRPV1）； powdery mildew resistance protein（MrRUN1）； LRR domain； disease resistance
0 引言
【研究意义】葡萄霜霉病是葡萄生产上的常见病害之一，严重制约了葡萄与葡萄酒产业的可持续发展（王壮伟等，2015）。圆叶葡萄起源于美国东南部，具有优良的抗病性和抗虫性，对霜霉病、皮尔斯病、根瘤蚜等病虫害高抗甚至免疫，目前已通过图位克隆从圆叶葡萄中克隆获得霜霉病抗性基因MrRPV1（Feechan et al.，2013），但有关其介导霜霉病抗性的具体机制尚不清楚。因此，明确MrRPV1蛋白各结构域的功能，可为揭示霜霉病的抗性机理提供理论依据。【前人研究进展】富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeat，LRR）是植物抗病蛋白一個非常重要的结构域，该结构域在抗病蛋白识别病原菌效应因子和蛋白—蛋白相互作用中发挥重要作用（Qi and Innes，2013）。Jia等（2000）研究表明，水稻Pi-ta蛋白单独的LRR结构域就能与对应的无毒蛋白Avr-Pita互作，与抗病品种相比，感病品种的Pi-ta基因在LRR结构域末端存在918A→S突变，且体内免疫共沉淀试验也检测到Avr-Pita与全长Pi-ta蛋白间的结合，为佐证LRR结构域与病原菌效应蛋白结合提供了证据支持。Tao等（2000）对拟南芥RPS2、RPM1及Dinesh-Kumar等（2000）对烟草N基因的研究表明，LRR结构域中单个氨基酸的改变就会导致抗病性丧失。Ellis等（2007）对亚麻锈病抗性蛋白的研究结果表明，LRR结构域是病原菌特异识别的主要决定因素。LRR结构域具有调节信号传导的功能。如拟南芥RPS2、RPS5和RPP1A的LRR结构域缺失后，防御反应一直处于激活状态（Tao et al.，2000；Michael Weaver et al.，2006）；过表达马铃薯Rx基因LRR结构域的截短蛋白可使超敏反应加强（Inohara et al.，2005），说明LRR结构域具有负调节抗性信号传导的作用。此外，有研究表明LRR结构域中至少有2个区域对结合NBS区域实现抑制信号传导发挥作用（Rairdan and Moffett，2006）。【本研究切入点】葡萄霜霉病抗性蛋白MrRPV1和白粉病抗性蛋白MrRUN1均属于典型的TIR-NBS-LRR类型，二者在染色体的同一个位点上，且氨基酸水平具有86%的相似性，主要差别在于羧基端LRR的重复数不同（Feechan et al.，2013）。其中，MrRPV1含有20个LRR重复，MrRUN1含有16个LRR重复，但二者较高的序列同源性和功能差异是否能通过结构域交换确定其对病原菌的特异识别尚需进一步验证。【拟解决的关键问题】利用结构域互换技术对MrRPV1蛋白LRR结构域的功能进行研究，旨在明确LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响，为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础。