低分子肝素对脑缺血再灌注大鼠ＮＦ－κＢ、ＭＰＯ活性的影响
【摘要】 目的 探讨低分子肝素(Low molecular weight heparin,LMWH)对核转录因子-κB p65(NF-κB p65)和髓过氧化物酶(MPO)活性的影响。方法 将Wistar大鼠135只，随机分为假手术组、缺血再灌注组(IR组)、LMWH治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。IR组于再灌注前5 min尾静脉注射LMWH，1．5 mg/kg。采用免疫组化法和生化法观察各组缺血90 min再灌注3、6、12、24、48 h 点NF-κB p65表达、MPO活性变化，并进行脑含水量检测、TTC染色和HE染色观察脑梗死体积及病理形态学变化。结果 ①假手术组及IR组的未缺血侧大脑半球可见少量NF-κB p65表达于胞质, 再灌注后NF-κB p65表达发生核移位，于胞核表达增加，再灌注12 h达高峰；与IR组比较，LMWH治疗组能减少NF-κB p65的核移位(P<0．05);②再灌注12 h后,MPO活性升高，于24 h达到高峰；与IR组比较，LMWH治疗组能减少MPO活性(P<0．05);③与IR组比较，LMWH治疗组脑含水量较IR组减少，脑梗死体积较IR组缩小，差异有统计学意义(P<0．05);④LMWH治疗组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于IR组;⑤假手术组、IR组和LMWH治疗组凝血酶原时间(PT)和白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)检测比较 ,差异无统计学意义(P> 0．05)。结论 脑缺血再灌注损伤出现NF-κB活化和中性粒细胞浸润的炎性反应级联反应。LMWH对脑缺血再灌注损伤有保护作用，可能与减少NF-κB p65活化和减轻中性粒细胞浸润有关，且对凝血指标PT 和KPTT无明显影响。
【关键词】再灌注损伤；核转录因子-κB p65；髓过氧化物酶；低分子肝素；大鼠
Effect of Low molecular weight heparin on NF-κB and MPO Activity of cerebral ischemia reperfusion injury in rats LIU Kai-xiang, LI Hao,FEN Jun-lin,et al.Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College ,Guilin 541002,China
【Abstract】 Objective TO study effect of Low molecular weight heparin(LMWH) on NF-κB p65 and MPO of cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods In this experiment, 135 Wistarrats were randomly divided into 3 groups, which were sham operated group, ischemia reperfusion group(IR group), LMWH treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. Rats were given LMWH by vena caudalis injection, 5 min before reperfusion.AfterMCAO following different durations of reperfusion,we investigated the expression of NF-κBp65 with using immunohistochemistry and investigated the MPO activityin the ischemic territory. The brain water content was examined.HE staining and TTC staining was also investigated. Results ①The translocation of NF-κBp65 from cytoplasm to nucleus increased significantly after reperfusion，and peaked at 12 h of reperfusion . Compared with IR group, LMWH treated group reduced expression ofNF-κBp65. ②MPO activitywasstarted to significantly increased at 12 h and peaked at 24 h of reperfusion in the ischemic territory. Compared with IR group,LMWH treated group reduced MPO activity. ③Compared with IR group,LMWH treated group reduced the brain water content and cerebral infarction volume was lower than IR group (P<0．05).④The change of ischemic impairment in LMWH treated groupwas lighter than that of IR group.⑤Compared with that of sham operated group, the prothrombin time(PT) and kaolin partial thromboplastin time (KPTT) of IR group and LMWH treated group have no difference.(all P>0．05). Conclusion There is inflammation reaction of NF-κBp65 and neutrophils infiltration after cerebral ischemia-reperfusion-injury. LMWH may reduced cerebral ischemia-reperfusion injure by decreasing the expression of NF-κBp65 and neutrophils infiltration，without affecting the clotting indices PT and KPTT.
【Key words】 Reperfusion injury; NF-κBp65; Myeloperoxidase; Low-molecular-weight heparin; Rats
研究表明，核转录因子(Nuclear Transcription Factor, NF-κB) 是具有多向性调节作用的一类重要的蛋白质因子，与脑缺血再灌注损伤后炎性反应机制密切相关。目前研究发现[1-2]肝素对炎症性疾病可能具有治疗作用，然而肝素强烈的抗凝活性,使其临床应用受到限制。低分子肝素(Low-molecular-weight heparin ,LMWH)由肝素衍生而来,不良反应出血较肝素明显减少,较具安全性。本实验通过建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，研究脑缺血再灌注损伤NF-κB p65表达和MPO动态变化规律，探讨再灌注损伤炎性反应机制及LMWH对再灌注损伤的保护作用机制。
1 材料与方法
1．1 材料 健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共135只，体质量(250±30)g(广西医科大学动物实验中心提供)。按随机分组原则分成假手术组(15只)、IR组(60只)、LMWH治疗组(60只)。IR组和LMWH治疗组各随机分为5个时间点，即脑缺血90 min再灌注3、6、12、24、48 h每个时间点10只。其中5只行脑切片，5只行脑组织匀浆。另随机取10只，5只至再灌注24 h行脑含水量检测，5只至再灌注24 h行TTC检测。
1．2 方法
1．2．1 给药方法 于再灌注前5 min尾静脉注射LMWH，剂量1．5 mg/kg，IR组给予等容积的生理盐水注射。
1．2．2 动物模型的建立 参照Longa等[3]的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0．27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等[3]评分标准，各组分别在再灌注24 h进行评分。0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全伸展右前肢；2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1~3分为模型成功。0分和4分为模型不成功予剔除，在后续实验中补充剔除出组的动物，保证每组动物数。
1．2．3 NF-κB p65的免疫组化染色 再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，大鼠用生理盐水和多聚甲醛进行心脏灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖端7~11 mm之间冠状切取约5 mm厚脑组织块，固定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚5 μm。连取5张，1张作HE染色，其余4张作免疫组化染色。用SP法进行NF-κB p65的免疫组化染色。一抗由武汉博士德生物工程公司提供。阴性对照片用PBS液代替一抗。采用SP法进行免疫组化染色。在400倍光镜下观察,以胞核或胞浆黄色或有棕黄色颗粒沉积的细胞为阳性细胞。在左侧大脑半球缺血组织不重复随机选取10个高倍视野,每个视野计数100个细胞。计算平均阳性细胞率［ (阳性细胞数/计数细胞总数) ×100%］。
1．2．4 MPO活性的测定 再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，将大鼠开颅取脑，在冰浴下取左侧大脑半球缺血组织，以试剂盒 (南京建成生物工程研究所) 提供的匀浆介质制成脑组织匀浆。严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计算出MPO活力单位。
1．2．5 脑含水量测定 再灌注24 h，各组随机取5只大鼠，断头取脑后,快速称取左右大脑半球湿重,置110~115℃烤箱内烤至恒重,再分别称其干重,用(湿重-干重) /湿重的百分比,作为衡量脑含水量指标。
1．2．6 TTC染色 再灌注24 h，将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑。将鼠脑置于－4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗死灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗死体积。
1．2．7 HE染色 取再灌注24 h大鼠脑切片进行常规HE染色，观察病理形态学改变。
1．2．8 凝血酶原时间(PT)和白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)检测 再灌注24 h取尾静脉血，分别检测血清PT和KPTT。
1．2．9 统计学分析 数据处理采用SPSS11．5统计软件进行运算，结果以均数±标准差(x±s)表示,组间检验采用方差分析。
2 结果
2．1 各组NF-κB p65表达的比较 假手术组及IR组的未缺血侧大脑半球可见少量NF-κB p65表达，主要存在于胞质,无明显核表达, 假手术组核阳性细胞数(8．876±1．78)%(图1)。IR组再灌注不同时间点缺血侧NF-κB p65表达发生核移位，棕黄色沉积物多表达在胞核， 3 h开始出现，再灌注12 h达高峰，48 h逐渐下降，再灌注各个时间点核阳性细胞数与假手术组比较，差异具有统计学意义(P<0．05)。核阳性细胞主要分布在缺血周边半暗区，在缺血核心区较少表达(图2)。与IR组比较，LMWH治疗组NF-κB p65核移位减少，核阳性细胞数减少，差异有统计学意义(P<0．05)，免疫阳性表达物在胞浆与胞核共存(图3)。
2．2 各组MPO活性变化的比较 假手术组MPO活性为0．026±0．013。IR组大鼠在再灌注各时间点， 缺血侧MPO活性较假手术组均有升高。再灌注3 h和6 h MPO活性与假手术组相比较，差异无统计学意义(P>0．05);再灌注12 h以后，各时间点与假手术组比较差异有统计学意义(P<0．05)，并于再灌注24 h达到高峰，此时与其他几个时间点相比较，差异有统计学意义(P<0．05)。LMWH治疗组再灌注6 h后各时间点MPO活性升高明显受抑制，和IR组相比较，差异有统计学意义(P<0．05), 再灌注3 hMPO活性升高和IR组相比较，差异无统计学意义(P>0．05)见表2。
2．3 各组脑含水量的比较 再灌注24 h,IR组缺血侧脑组织含水量明显增多；与IR组比较， LMWH治疗组脑组织含水量下降,差异具有统计学意义(P<0．05) 。各组非缺血侧脑组织水含量差异无统计学意义。见表3。
2．4 各组脑梗死体积的比较 LMWH治疗组脑梗死体积较IR组缩小，差异具有统计学意义(P<0．05) 。见表3。
2．5 HE染色 假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显(图4)。IR组呈缺血改变，梗死区正常组织结构消失，间质水肿，有炎性细胞浸润；锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红，可见呈筛状坏死的坏死灶(图5)。LMWH治疗组脑组织缺血改变较IR组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻(图6)。
2．6 PT和KPTT检测 假手术组PT 为(13．4 ±1．2) s ,KPTT 为(17．9±1．0) s。IR组PT 和KPTT 分别为(14．2 ±1．3) s 和(17．7±1．4) s ; LMWH治疗组PT 和KPTT 分别为(14．6 ±0．9) s 和(18．7 ±1．1) s ,经统计学处理,各组之间差异无统计学意义(P> 0．05) 。
3 讨论
NF-κB是一种普遍存在于真核细胞中具有序列特异性二聚体结构,在神经系统中, NF-κB广泛分布于神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。NF-κB是由NF-κB / Rel蛋白家族成员组成的同源或异源二聚体。其中P50/P65 二聚体是最早被发现, 也是存在最广泛的NF-κB p65二聚体形式, 通常所说的NF-κB指的就是P50/P 65 二聚体。静息状态下, NF-κB与其抑制因子IкB (Inh ibito r of nuclear facto r-kappaB) 结合成复合物存在于细胞浆中, 没有生物活性,在诸如缺血缺氧等应激条件下,NF-κB 被激活, 从而启动相关靶基因的转录, 能将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达。我们研究结果显示，假手术组及IR组的未缺血侧大脑半球, NF-κB p65 一直以存在于胞质内为主,无明显核移位；再灌注后缺血侧NF-κB p65发生核移位,核表达增加，于再灌注12 h达高峰，提示在再灌注后NF-κB p65明显从胞质移位于胞核，表明NF-κB p65 在缺血后被激活。Nurmi 等[4]检测脑梗死患者NF-κB 的免疫反应性,发现在脑梗死1~ 2 d后, NF-κB 被诱导并移位至胞核,表明人脑缺血后,NF-κB 亦被激活,并从胞浆移位至胞核。Clemens等[5]发现, 大鼠脑缺血后在海马CA 1 区, NF-κB 从胞浆移位至胞核,同时发现p65和 p50mRNA表达均增加, 提示脑缺血发生后, 不仅处于静息状态的NF-κB 被激活, 而且其在转录和翻译水平上的表达亦增加。
近年发现,活化的转录因子NF-κB 与炎性反应密切相关。脑缺血再灌注后活化的NF-κB 可以上调表达的细胞因子有IL-1β(白细胞介素-1β)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α) 等, 此外,NF-κB 可促进ICAM-1 (细胞间黏附分子-1)、VCAM (血管细胞间黏附分子)等黏附分子的表达, 介导外周炎性细胞如中性粒细胞进入脑组织[6]。MPO主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中，其活性能反映中性粒细胞在脑组织中浸润程度。本研究结果也显示，大鼠脑缺血再灌注24 h，MPO活性明显增加，表明缺血侧脑组织已经发生了以中性粒细胞浸润为标志的炎性反应过程。由此我们可以推断，NF-κB活化是介导或是加剧脑缺血再灌注损伤炎性反应的中心环节。Williams 等[7]在大鼠脑缺血模型研究中发现,蛋白酶体抑制剂MLN519 能够降低激活的NF-κB 的免疫活性,减少中性粒细胞浸润,有效降低神经元和星形细胞的退行性变。目前，通过阻断NF-κB 信号通路或抑制NF-κB 的DNA 结合活性,成为研究减轻脑缺血再灌注后炎性损伤的新热点。
LMWH是由普通肝素解聚而成，采用酶法或化学法降解而得到的平均分子量在4~6 kD之间的组分或片段,具有高比例的抗因子Xα和抗因子Ⅱα活性,生物利用度更高，不良反应出血较肝素明显减少，是一种疗效确切的抗凝剂。近年研究发现，LMWH对缺血再灌注损伤后的炎性反应有抑制作用。Libersan-D[8]等应用LMWH治疗狗心肌缺血再灌注，发现LMWH减少中性粒细胞聚集，减小梗塞面积。本实验也通过给予一定剂量的LMWH来探讨其抗炎作用。我们发现LMWH能减轻脑水肿，缩小脑梗死体积，对缺血再灌注脑损伤有保护作用。同时大鼠PT 和KPTT 测定结果显示, LMWH治疗组PT 和KPTT 与IR组相比差异无统计学意义，表明该剂量低分子肝素无明显的抗凝活性，这与Bjornsson等[9]报道的结果一致。我们实验还发现，LMWH对缺血再灌注后缺血侧NF-κB的核移位具有抑制作用，减少NF-κB活化，显著减少MPO活性，表明该剂量低分子肝素同时具有良好的抗炎作用，提示LMWH可能通过抑制NF-κB介导的炎性级联反应对缺血再灌注脑损伤有保护作用。低分子肝素可能是减轻脑缺血再灌注损伤后炎性反应的一种有效且安全的药物。
参考文献
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