辅助性T细胞17在免疫相关性全血细胞减少症中的免疫调节功能研究

材料和方法

1.1病例

27例患者均取自于云南省第一人民医院血液科初治住院病人，其中男14例，女13例，年龄13～60岁。其中16例明确诊断组经常规检查已排除已知的各种血液系统疾病，且按文献[2]标准拟诊断为IRP。另11例为造血衰竭疾病组，分别诊断为骨髓增生异常综合征4例、再生障碍性贫血3例、阵发性睡眠性血红蛋白尿4例，均符合国内诊断标准[3]。复诊组12例为IRP经免疫干预治疗后血常规恢复正常患者，达到完全缓解组（CR组）。正常对照组22例，其中男11例，女11例，年龄6～18岁。

1.2实验分组

27例患者分别为A组（确诊IRP组）、B组（造血衰竭疾病组）及C组（免疫干预治疗后达完伞缓解组（CR组））另设正常对照组（22名正常人）。A组16例按文献[2]确诊为IRP患者。B组11例（其中骨髓增生异常综合征4例、再生障碍性贫血3例、阵发性睡眠性血红蛋白尿4例）。C组12例。采用流式细胞术（FCM）检测A、B、C组及正常对照组骨髓白细胞介素（IL）-23受体（JL-23R）+CD4+/CD4+细胞比率。酶联免疫吸附法（ELISA）检测A、B及正常对照组骨髓卜清液IL-6、IL-17、IL-23水平。

1.3试剂与仪器

异硫氰酸荧光素（FlrC）标记的鼠抗人CD3单克隆抗体，藻红蛋白（PE）标记的鼠抗人CD4单克隆抗体以及它们各自的同型对照均购自于美国Beckman Coulter公司，纯化的人类IgG、PerCP标记的IL-23R以及其同型对照均购自R&D公司。流式细胞仪型号FC500 MPL为美国BeckmanCoulter公司产品。IL-6、IL-17、IL-23 ELISA检测试剂盒均为Bio-Swamp品牌试剂盒。

1.4 FCM检测骨髓11-23R+CD4+细胞占CD4+细胞比率

取两支检测管，分别加入新鲜肝素抗凝骨髓液100μL，加入适量PBS液于离心机内洗涤2次，弃上清液后加入封闭剂人类IgG 20μL，常温孵育15min，一管中加入CD4-PE、CD3-FITC、IL-23R-PerCP各20μL，另一管加入CD4-PE、CD3-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，4℃避光孵育40min，取出均加入红细胞裂解液，混匀后孵育10min，加入适量PBS液混匀。同型对照加入IgG1-PE、IgG2-FITC、IgG2b-PerCP各20μL，其他均按同样方法操作。处理好的样品用流式细胞术测定IL-23R+CD4+细胞、CD4+细胞比率。每个样本收集15000个细胞。

1.5ELISA法检测骨髓上清IL-6、IL-17和IL-23水平

取骨髓于离心机内离心，分别收集上清液。细胞因子水平上清液按ELISA试剂盒说明书操作。

1.6统计学处理

对正态分布的数据变量以χ±s表示，应用SPSS19.0数据软件进行t检验和相关性回归分析。

2结果

2.1骨髓IL-23R+CD4+/CD4+细胞比率

确诊IRP组患者IL-23R+CD4+/CD4+细胞比率[3.22±1.67]明显高于B组[1.51±1.06]和正常对照组[1.59±1.06]（P<0.05），同时IRP确诊组患者IL-23R+CD4+/CD4+细胞比率[3.22±1.67]也明显高于C组[1.72±0.83]。B组、C组及正常对照组相互间差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。骨髓IL-23R+CD4+/CD4+细胞检测典型图例见图1。

2.2骨髓上清IL-6、IL-17、IL-23水平

IRP组骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明显高于造血衰竭疾病组和正常对照组（P<0.05），而造血衰竭疾病组和正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3讨论

免疫相关性全血细胞减少症是当前医学界热门课题之一，它是在鉴别骨髓造血功能衰竭综合征时发现的一类新型血细胞减少疾病。目前认为该类疾病是因为机体产生了抗骨髓未成熟造血细胞自身抗体，进而导致一系、两系或全血细胞减少。近年来，临床采用肾上腺皮质激素、静脉病种球蛋白、环磷酰胺、环孢素等免疫抑制剂取得了客观的疗效，有学者采用造血干细胞移植技术的探索也有进步，前景喜人。因而，探索IRP治疗的新途径、新靶点是有意义的工作[2，6]。

目前认为骨髓造血细胞自身抗体的产生是由于T淋巴细胞调控失衡所致。既往有学者发现此类患者Thl细胞与Th2细胞平衡明显向Thl细胞降低倾斜，即Thl细胞途径的抑制性负调控减低，Th2细胞途径的刺激性正调控增强，细胞功能亢进，更有研究显示免疫相关性全血细胞减少症骨髓中Th2细胞高于Thl细胞3倍[4]，故体液免疫功能亢进。Th17细胞是一种不同于Thl和Th2型的第3类效应性T细胞，主要分泌IL-17、IL-17F及少量IL-6和TNF-a等细胞因子，其中IL-17是家族中最先发现的分子，也是Th17细胞发挥效应及介导疾病的核心因子。该细胞具有独立分化和发育调节机制，在自身免疫性疾病中扮演着重要角色，研究显示Th17细胞在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等患者中均发现其数量增多、功能亢进[5]。可见，Th17细胞及其分泌的细胞因子参与多种自身免疫性疾病的发生和发展。来自初始免疫细胞和调节细胞的TGF-β是促进初始CD4+细胞分化Th17细胞的始动因素，除TGF-β外，IL-6在协同TGF-β共同诱导Th17细胞分化方面也发挥关键作用，TGF-p只有在IL-6协同下才能诱导Th17细胞的分化[6，7]。研究发现TGF-β和IL-6可驱使原始T细胞分化为Th17细胞，但与之伴随产生的IL-10的炎症抑制效应在一定程度上降低了Th17细胞的致病潜力。IL-23作用于成熟Th17细胞表面的IL-23R，能够维持和扩大Th17细胞的分化和功能，而IL-23介导的Th17细胞分化过程中不生成IL-10但增加IL-17的致病效应[8]。

本文采用流式细胞术检测确诊IRP患者组（A组）、造血衰竭疾病组（B组）、完全缓解组（C组）和正常对照组的骨髓IL-23R+CD4+/CD4+细胞比率。经统计学分析表明，A组患者IL-23R+CD4+/CD4+比率明显高于B组患者及正常对照组，后两组无显著性差异。A组阳性患者IL-23R+CD4+/CD4+比率也明显高于C组。说明IRP患者中Th17细胞数量增多、功能活跃，可能与IRP患者的免疫功能相关，此结果与既往研究相符[1]。其造血衰竭疾病患者（PNH、AA、MDS）Th17细胞比率趋于正常，据此我们可以将免疫相关性全血细胞减少症与其他全血细胞减少加以区分。Th17细胞作为促炎细胞，能诱导免疫性疾病的发生，而Treg的功能却和它截然相反。研究证实：Th17细胞和Treg在各自的分化生成、转录水平上均存在着相互制约关系，然而在特定的细胞因子环境中，Treg可以转化成Th17细胞[9，10]。

酶联免疫法实验显示：A组患者骨髓上清液IL-6、IL-17和IL-23水平明显高于B组和正常对照组。说明IRP患者骨髓上清液IL-6、IL-17、1L-23水平增高，提示IL-23介导的Th17细胞分化亢进可能是IRP发病原因之一。免疫干预治疗可以显著降低Th17细胞比率及IL-23R，抑制Th17细胞分化亢进可能是治疗IRP的一个靶点。

综上所述，本文推测Th17细胞在IRP患者中的免疫调节机理可能是：IRP患者体内IL-6水平增加，其协同TGF-β诱导Th17细胞的分化，同时IL-23作用于成熟的Th17细胞，进一步维持和扩大Th17细胞的分化和功能，引起Th17细胞数量增多、功能亢进，进而其分泌的细胞因子IL-17增多，1L-17激活细胞表面对应受体（IL-17R），导致趋化因子、集落刺激因子和粘附分子的表达或释放，招募炎症细胞如中性粒细胞，进而引起细胞侵润和组织破坏，影响感染、肿瘤和自身免疫的病理过程。结合Th17细胞的生物学作用分析，IRP患者骨髓造血细胞自身抗体的产生可能与Th17细胞数量增多和功能亢进存在一定相关性，但深入的相关机制有待于进一步研究。

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