稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子的MSAP分析
材料，采用DNA甲基化敏感扩增多态性技术对供试材料基因组DNA进行甲基化分析，探究稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式。结果显示，3种形态孢子的基因组DNA甲基化水平差异明显，分生孢子基因组DNA中CCGG序列的总甲基化率为20.56%，黑色休眠厚垣孢子为25.63%，黄色非休眠厚垣孢子为33.52%。黄色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，其全甲基化率高于半甲基化率，其中黄色厚垣孢子全甲基化率高达17.68%;分生孢子则是以半甲基化模式为主。结果对揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠的分子机制，探究真核生物孢子的分子休眠机制有普遍意义。
关键词稻曲病菌;厚垣孢子;分生孢子;DNA甲基化;甲基化敏感扩增多态性
中图分类号：S 435.111
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2017475
稻曲病是由稻绿核菌Ustilaginoidea virens （Cooke） Takahashi[有性态为Villosiclava virens （Nakata） E.Tanaka & C.Tanaka，异名Claviceps oryzaesativae Hashioka] 侵染引起的水稻穗部病害[1]。该病在亚洲、美洲和非洲的30多个国家及我国各稻区都有不同程度发生。一般穗发病率为4%～6%，严重达50%以上。它不仅使秕谷率、青米率、碎米率增加;而且当稻谷中含有0.5%病粒时能引起人畜中毒症状[17]。该病在我国无论是从发生面积，还是从引起的产量损失上看，都已成为水稻尤其是杂交稻最重要的病害之一[2， 4]。
在稻曲病发展过程中，稻曲球中的厚垣孢子在发育过程中存在颜色转变，即从最初乳白色至黄色再到墨绿色（亦称之黑色），黄色厚垣孢子的萌发率可高达80%以上。随着厚垣孢子颜色变深，萌發率下降，当变成黑色厚垣孢子就很难萌发或不能萌发[89]。这种由非休眠（黄色）至休眠（黑色）状态的转变对厚垣孢子度过不良环境和宿主缺乏期 （在植物病理学上的越冬或越夏） 有重要的生物学意义。厚垣孢子在稻曲病的侵染循环中起重要作用，是稻曲病的主要初侵染源[812]。
DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰。它是指由DNA甲基转移酶（DNMTase）介导，在胞嘧啶的第5位碳原子上加上1个甲基基团，使之变成5甲基胞嘧啶（5mC）的化学修饰过程。在各种疾病的致病机制中，甲基化模式异常这一因素所起的作用各不相同。在真核生物中通常DNA的甲基化会抑制基因表达。DNA的甲基化状态对染色体的结构维持、X染色体失活、基因印记及胚胎发育、正常细胞功能的维持，组织特异性基因的表达和转座子沉默，乃至疾病的发生十分重要[1314]。
关于真菌DNA甲基化研究，早在1983年Tamame等[15]利用5氮杂胞苷（5azacytidine）对Aspergillus niger和A.nidulans的菌丝进行诱变，研究其野生型和诱变型菌丝DNA甲基化，结果显示，它们在DNA甲基化方面没有差异。随后，1984年Antequera等[16]对涵盖5个科的20个种（包含壶菌、卵菌、接合菌、子囊菌、担子菌和半知菌）进行了DNA甲基化检测，其中18个种DNA甲基化率≤0.1%，而Sporotrichum dimorphosporum和 Phycomyces blakesleeanus的DNA甲基化率则分别约为0.2%和0.5%。研究表明，真菌中存在DNMTase和甲基化区域[1719]。对模型真菌子囊菌粗糙脉孢菌Neurospora crassa的研究显示，真菌DNA甲基化是一种特定的基因组防御，因经过重复诱导点突变没有发现结构基因、沉默转座因子和重复的DNA序列[2021]。在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中存在DNA甲基化，反转录转座子MAGGY对反转录的限制作用与DNA甲基化没有相关性[22]。不同的M.oryzae单孢其甲基化也有差异，缺失MoDMT1的突变体菌株与正常菌株的生长无差异[23]，但DNA甲基化在全基因组分布和对真菌的生活周期的意义是未知的。Jeon等[24]分析了M.oryzae的DNA甲基化，表明DNA甲基化有助于真菌的生长发育和基因组防御。
本研究以稻曲病的黄色、黑色厚垣孢子和厚垣孢子萌发后产生的分生孢子为材料，采用甲基化敏感扩增多态（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术对供试材料的基因组DNA进行甲基化分析，旨在探究稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式，这有利于揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠分子机制，对探究真核生物分子休眠机制具有一定的理论价值。
1材料与方法
1.1供试病菌
从高感稻曲病水稻品种‘红莲优6号’采集病粒稻曲球，分离稻曲病菌的单孢，用燕麦培养基（燕麦片30 g，琼脂20 g，水加至1 000 mL）培养。并用PS培养液（马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）在水平摇床上26℃黑暗条件下130 r/min恒温振荡培养获得分生孢子。在无菌环境下将分生孢子悬浮液与捣碎的菌丝片段混匀，孢子浓度调至4×105个/mL并接种到水稻品种‘红莲优6号’上，发病后收集黄色、黑色的稻曲病菌厚垣孢子。将获得的孢子保存于-80℃冰箱备用。
1.2供试试剂
基因组DNA提取试剂盒，OMG公司。EcoRⅠ、MspⅠ、Hpa Ⅱ、10×Buffer T等，纽英伦生物技术（北京）有限公司。基因组DNA接头的连接试剂（T4 DNA Ligase，基因组DNA的预扩增和选择性扩增试剂）等，北京全式金生物技术有限公司;电泳及银染试剂为国产;EcoRⅠ接头、HpaⅡ-MspⅠ接头、扩增引物等，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物及接头序列见表1。
1.3基因组DNA的提取
采用基因组DNA提取试剂盒分别提取稻曲病菌的分生孢子、黄色和黑色厚垣孢子基因组DNA，具体操作步骤参照试剂盒上的说明。并用核酸分析仪测定260 nm、280 nm时的吸光度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。
1.4基因组DNA的甲基化MSAP体系建立
1.4.1基因组DNA的双酶切
分别使用限制性内切酶EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ和EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ对 DNA 进行双酶切。将提取的DNA （500 ng） 5.0 μL，EcoRⅠ（20 U/μL）0.5 μL，MspⅠ（或HpaⅡ）（20 U/μL）0.5 μL，10×Buffer T 2.5 μL，加水至25 μL，混匀后于低温恒温水浴槽37℃酶切保温12 h，65℃温育20 min，4℃保存。
1.4.2基因组DNA接头的准备与连接
将EcoRⅠ接头引物分别配成15 μmol/L 的保存液，混合稀释成5 μmol/L;HpaⅡMspⅠ接头引物分别配成100 μmol/L的保存液，混合配成50 μmol/L。混合均匀后置于PCR仪：65℃ 10 min;37℃ 10 min;25℃ 10 min，然后自然冷却至室温。将酶切产物8.5 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4.0 μL，EcoR Ⅰadapter （5 μmol/L） 2.0 μL，Hpa ⅡMsp Ⅰadapter （50 μmol/L）2.0 μL，补水至20 μL，混匀后于低温恒温水浴槽16℃培养过夜，70℃灭活10 min，-20℃保存。
1.4.3基因组DNA的预扩增
预扩增总体积25 μL，包括连接产物2.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L预扩增上下游引物各1.0 μL。扩增程序为：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环;72℃ 10 min。
1.4.4基因组DNA的选择性扩增
预扩增产物20倍稀释液5.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L选择性上下游引物各15 μL，总体积25 μL。扩增程序为：94℃ 30 s，65℃（每个循环降低0.7℃）30 min，72℃ 1 min，13个循环;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23个循环;72℃ 10 min。
1.4.56%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
将选择性扩增产物进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用美国BIORAD 公司的PowerPac HV电泳仪，恒定电压1 800 V进行预电泳30 min，使凝胶预热。然后上样，1 200 V电泳2.0～2.5 h，待二甲苯青移动至整个凝胶的2/3处时，停止电泳，取出凝胶，银染显色。
1.5数据分析
统计显影后的聚丙烯酰胺凝胶电泳条带，将清晰条带显示记为“1”，无条带显示处记为“0”，记录所有适宜选扩增引物组合的MSAP图谱，组成二次元矩阵， 进行甲基化多态性统计[25]。
2结果与分析
2.1基因组DNA的选择性扩增
甲基化敏感扩增多态性（MSAP）中使用的内切酶MspⅠ和HpaⅡ是一组同裂酶，都识别并切割5′CCGG3′序列，但在5′CCGG3′存在甲基化时，两种酶对该序列不同甲基化状态的敏感度不同。MspⅠ只能切割外部胞嘧啶没有发生甲基化的5′CCGG3′序列，一旦外部胞嘧啶发生甲基化，将不能切割此位点。HpaⅡ对半甲基化（单链甲基化）敏感，对全甲基化（双链甲基化）不敏感，只切割半甲基化的5′CCGG3′序列。
因此，聚丙烯酰胺凝膠电泳获得的条带可分为4种类型：Ⅰ型，两条泳道均有带，表示无甲基化或单链内部发生甲基化;Ⅱ型，MspⅠ酶切产物扩增泳道有带，HpaⅡ酶切产物扩增泳道无带，表示发生双链内部甲基化;Ⅲ型，HpaⅡ酶切产物扩增泳道有带，MspⅠ酶切产物扩增泳道无带，表示发生单链外部甲基化;Ⅳ型，不存在CCGG位点，或内侧和外侧胞嘧啶同时甲基化（图1）。据报道[2627]，第四种甲基化类型的频率很低，因此我们得到的甲基化水平可能只比实际的低一些。
2.2基因组DNA甲基化水平和模式
EcoR Ⅰ选择性扩增引物分别与Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ选择性扩增引物配对，从120对MSAP选择性扩增引物中筛选出28对扩增图谱清晰、甲基化多态性丰富、条带重复性好的选择性扩增引物组合。采用2.1的带型统计方法记录PAGE胶上的扩增条带，结果如表2所示。
根据对稻曲病菌的分生孢子、黑色和黄色厚垣孢子基因组DNA进行MSAP分析，可以看出分生孢子基因组DNA中CCGG序列的甲基化率为20.56%，黑色厚垣孢子为25.63%，黄色厚垣孢子为33.52%。其中分生孢子DNA的甲基化率最低，黄色厚垣孢子DNA的甲基化率最高。
在分生孢子、黑色和黄色厚垣孢子DNA的扩增条带中，全甲基化条带数分别为135、116、154条，全甲基化率分别为8.73%、13.96%、17.68%，分生孢子全甲基化率低于半甲基化率，黑色和黄色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。从统计结果看出DNA甲基化在稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子中发生普遍，在稻曲病菌分生孢子和厚垣孢子之间，基因组DNA甲基化水平差异明显，黄色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，分生孢子则是以半甲基化模式为主。
3讨论
MSAP （甲基化敏感扩增多态性） 技术是检测基因组DNA甲基化的重要方法之一，它是在AFLP技术的基础上，根据MspⅠ和HpaⅡ对甲基化敏感性的不同来区分基因组DNA全甲基化和半甲基化状态，同时可以测出其总甲基化水平[28]。
稻曲病菌引起水稻穗粒发病，在穗粒上形成稻曲球，稻曲球中的孢子座产生粉状厚垣孢子，厚垣孢子在发育过程中其颜色会发生变化，由乳白色逐渐变成黄色，最终成为墨绿色（黑色），即厚垣孢子由非休眠状态转化成休眠状态，这种现象属于表观遗传特征。厚垣孢子在非休眠和休眠的转换中，其表观遗传上有明显差异，这种差异与DNA甲基化相关。本研究采用MSAP技术，以稻曲病菌的分生孢子及两种颜色的厚垣孢子为材料，初次对稻曲病菌分生孢子、休眠与非休眠厚垣孢子的基因组DNA甲基化水平和模式进行研究，结果显示，稻曲病菌分生孢子、黑色和黄色厚垣孢子DNA甲基化水平差异明显，休眠的黑色厚垣孢子的甲基化要低于非休眠的黄色厚垣孢子。这个结论与种子萌发甲基化水平变化是相似的，黄韫宇等[29]用NaCl处理黄瓜种子，发现黄瓜种子在萌发过程中甲基化水平是不断变化的，前期甲基化水平略高，中后期甲基化水平降低，发芽末期甲基化水平更低，与Mishra等[30]报道的比较一致， Candida albicans 是人类真菌性病原物，其DNA甲基化调控影响的基因通常与形态转化，如酵母态与菌丝态形态转换、白色细胞与非透明细胞的转化，以及铁离子代谢相关的基因有关。C. albicans在无性生长期间，被压制转录甲基化位点中C转换成T 的频率提高，一个进化上稳定的抑制突变的模式可能会因为环境或寄主变化而发生遗传改变。稻曲病菌的3种不同发育时期的孢子的DNA甲基化调控的基因可能影响其萌发，利用MSAP方法获得稻曲病菌3种孢子的甲基化差异性位点的DNA片段，通过克隆测序可获得相应的基因的重要信息，从而可找到甲基化差异基因的表达与休眠的相关性。另外，通过分析甲基化位点，发现全甲基化，即双链甲基化是稻曲病菌休眠与非休眠基因组DNA甲基化的主要模式，分生孢子DNA则表现为全甲基化率低于半甲基化率，以半甲基化为主要模式;黑色和黄色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。此结论与种子萌发中，大量基因上调表达相一致，且种子萌发过程中同时还发现少量的甲基化事件，说明部分功能基因处于关闭或正在关闭的调控状态[3134]。稻曲病菌由可萌发的黄色厚垣孢子到不可萌发的黑色厚垣孢子，由厚垣孢子到萌发后的分生孢子之间的胞嘧啶甲基化率降低、甲基化模式改变，其分子机理有待进一步研究和验证。
参考文献
[1]TAKETO A， MAMI T， JOUJI M， et al. A refined inoculation method to evaluate false smut resistance in rice [J].Journal of General Plant Pathology，2011，77：1016.
[2]王金辉，陈越华.湖南省2004年中、晚稻稻曲病流行情况调查[J].中国植保导刊，2005，25（8）：1415.
[3]姜慎，唐春生，谭志琼.国内外稻曲病研究现状[J].热带农业科学，2010，30（3）：6266.
[4]邓根生.国内稻曲病研究现状[J].植物保护，1989，15（6）：3940.
[5]吕世琼，刘浩，赵江林，等.稻曲菌素研究进展[J].中国农学通报，2010，26（14）：265268.
[6]SUN Xianyun， KANG Shu， ZHANG Yongjie， et al. Genetic diversity and population structure of rice pathogen Ustilaginoidea virens in China [J/OL].PLoS ONE，2013，8（9）：e76879.
[7]GUO Xiaoyi， LI Yan， FAN Jing， et al. Progress in the study of false smut disease in Rice [J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2012：12111217.
[8]劉安国，何念杰，汪金莲.稻曲病菌[Ustilaginoidea virens （Cooke） Takahashi]厚垣孢子发芽力的研究[J].江西农业大学学报，1989，11（3）：2934.
[9]王疏，白元俊，周永力，等.稻曲病菌的病原学[J].植物病理学报，1998，28（1）：1924.
[10]王国良.稻曲病菌厚垣孢子侵染时期和侵染途径的研究[J].植物保护学报，1992，19（2）：97100.
[11]陆凡，陈志谊，陈毓苓，等.稻曲病菌的生物学特性及其侵染循环中某些未确定要点的研究[J].江苏农业学报，1996，12（4）：3540.
[12]左广胜，冉西京，杜生茂，等.稻曲病菌初侵染源研究[J].中国农学通报，1996，12（5）：1718.
[13]SCHAEFER C B， OOI S K T， BESTOR T H， et al. Epigenetic decisions in mammalian germ cells [J]. Science， 2007， 316： 398399.
[14]REIK W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development [J].Nature，2007，447： 425432.
[15]TAMAME M， ANTEQUERA F， VILLANUEVA J R， et al. Highfrequency conversion to a “fluffy” developmental phenotype in Aspergillus spp. by 5azacytidine treatment： evidence for involvement of a single nuclear gene [J]. Molecular and Cellular Biology， 1983， 3（12）： 22872297.
[16]ANTEQUERA F， TAMAME M， VILLANUEVA J R， et al. DNA methylation in the fungi [J]. The Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（13）： 80338036.
[17]DHILLON B， CAVALETTO J R， WOOD K V， et al. Accidental amplification and inactivation of a methyltransferase gene eliminates cytosine methylation in Mycosphaerella graminicola [J]. Genetics， 2010， 186： 6777.
[18]LIU Siyang， LIN Jianqing， WU Honglong， et al. Bisulfite sequencing reveals that Aspergillus flavus holds a hollow in DNA methylation [J/OL]. PLoS ONE， 2012， 7（1）： e30349.
[19]ZEMACH A， MCDANIEL I E， SILVA P， et al. Genomewide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation [J]. Science， 2010， 328： 916919.
[20]HONDA S， LEWIS Z A， HUARTE M， et al. The DMM complex prevents spreading of DNA methylation from transposons to nearby genes in Neurospora crassa [J]. Genes & Development， 2010， 24（5）： 443454.
[21]LEWIS Z A， ADHVARYU K K， HONDA S， et al. DNA methylation and normal chromosome behavior in Neurospora depend on five components of a histone methyltransferase complex， DCDC [J/OL].PLoS Genetics，2010，6（11）： e1001196.
[22]REYNALOPEZ G E， SIMPSON J， RUIZHERRERA J. Differences in DNA methylation patterns are detectable during the dimorphic transition of fungi by amplification of restriction polymorphism [J].Molecular Genetics and Genomics，1997，253：703710.
[23]IKEDA K， VAN VU B， KADOTANI N， et al. Is the fungus Magnaporthe losing DNA methylation？[J]. Genetics， 2013， 195： 845855.
[24]JEON J， CHOI J， LEE G W， et al. Genomewide profiling of DNA methylation provides insights into epigenetic regulation of fungal development in a plant pathogenic fungus， Magnaporthe oryzae [J]. Scientific Reports， 2015， 5：8567.
[25]JAROSLAV F， ALES K. How to interpret methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP） profiles？[J]. BMC Genetics， 2014， 15：2. DOI： 10.1186/1471 2156152.
[26]NAKAYASHIKI H， IKEDA K， HASHIMOTO Y， et al. Methylation is not the main force repressing the retrotransposon MAGGY in Magnaporthe grisea[J]. Nucleic Acids Research， 2001， 29（6）： 12781284.
[27]SALMON A， AINOUCHE M L， WENDEL J F，et al. Genetic and epigenetic consequences of recent hybridization and polyploidy in Spartina （Poaceae） [J].Molecular Ecology，2005，14：11631175.
[28]李衛国， 常天俊， 龚红梅. MSAP技术及其在植物遗传学研究中的应用[J]. 生物技术， 2008， 18（1）： 8387.
[29]黄韫宇， 张海军， 邢燕霞， 等. NaCl 胁迫对黄瓜种子萌发的影响及DNA甲基化的MSAP分析[J]. 中国农业科学， 2013， 46（8）：16461656.
[30]MISHRA P K， BAUM M， CARBON J. DNA methylation regulates phenotypedependent transcriptional activity in Candida albicans [J]. PNAS， 2011， 108（29）： 1196511970.
[31]褚会娟， 张今今， 王喆， 等. 丹参MSAP分子标记技术体系的优化及其应用[J]. 西北植物学报， 2011（5）： 920928.
[32]SANTOS D， FEVERIRO P. Loss of DNA methylation affects somatic embryogenesis in Medicago truncatula [J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002，70（2）：155161.
[33]XIA Ran， WANG Junguo， LIU Chunyan， et al. ROR1/RPA2A， a putative replication protein A2， functions in epigenetic gene silencing and in regulation of meristem development in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2006，18（1）：85103.
[34]丛建民， 陈凤清， 沈海龙， 等. 水曲柳胚后熟时期MSAP分析[J].南京林业大学学报， 2015， 39（3）： 3944.
（责任编辑：杨明丽）