预缺血通过NMDA受体抑制海马CA1区线粒体内细胞色素c向胞质释放的研究
材料与方法
1.1实验动物和试剂
由本校实验动物中心和中科院上海实验动物中心提供的SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，250～300 g，自由进食，昼夜交替照明。将大鼠随机分为假手术组、脑缺血/再灌注组、预缺血组、脑缺血/再灌注加生理盐水组、预缺血前给予MK801组、预缺血前给予生理盐水组。兔多克隆抗Cyt c（#4272）和兔多克隆抗COXⅣ（#4844）购于Cell Signaling Technology公司，硝酸纤维素（NC）膜购于Amersham公司，NBT/BCIP购于Promega公司，牛血清白蛋白（组分Ⅴ）购于Amresco公司，工具药（MK801）和一些化学试剂均从Sigma-Aldrich公司购得，其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1大鼠脑缺血及预缺血模型的制备 采用大鼠四动脉结扎模型[13]，首先以20%水合氯醛（300～350 mg/kg）腹腔注射麻醉，然后分离双侧颈总动脉，并用细绳缠绕双侧颈总动脉，以利于第2天拎起。椎动脉电凝以阻塞椎动脉血供，大鼠自由进食，术后第2天，于大鼠清醒状态下拎起颈总动脉，采用动脉夹夹闭，全脑缺血6 min后取下动脉夹开始恢复血供，再灌注6 h。预缺血组先给予3 min的预缺血后复灌注3 d再给予缺血6 min，并再灌注6 h，缺血模型的可靠性以体征表现判断。假手术组前期操作同缺血动物，但不夹闭双侧颈总动脉。MK801溶于生理盐水，在预缺血前60 min腹腔注射给药3 mg/kg。溶剂对照动物腹腔注射等体积生理盐水。
1.2.2线粒体的提取 在冷库中进行下述操作：大鼠缺血复灌6 h，快速断头取脑，分离出双侧海马组织，沿海马裂分离出CA1部分，为避免冰冻引起Cyt c从线粒体向胞浆释放，新鲜海马CA1区中立即加入1∶10（w/v）冰冷的匀浆缓冲液，以Glas-col匀浆器速匀浆，10 s×6次，然后以1000×g 4℃离心15 min，弃沉淀，转移上清再以17 000×g 4℃离心20 min，所得上清即作为胞质部分，测蛋白后分装，-80℃冰箱保存待用；对应所得的沉淀即为与胞质对应的粗制线粒体部分，测蛋白后分装，-80℃冰箱保存待用。
1.2.3蛋白含量测定 按照改良Lowry′s法[14]，标准蛋白采用牛血清蛋白（BSA，组分ν）。
1.2.4免疫印迹（immunoblot，IB） 取分装好的含相同蛋白量的样品，分别加入1/3体积的4×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min变性。上样等量的100 μg变性蛋白质样品与凝胶孔中，经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，电转至NC膜上，NC膜置以封闭液室温孵育3 h后，取出放入一抗工作液中孵育，4℃过夜，以TBST洗膜（5 min×3次）后，放入AP标记的二抗工作液中孵育，室温2 h，再以TBST洗膜（3 min×5次），然后水洗，并放入以NBT/BCIP试剂盒新鲜配制AP显色液中显色，以流水洗涤终止显色。扫描NC膜上显色条带，并采用Quantity One软件分析。
1.3统计学处理
采用Image J 1.37、Sigma STAT32、Sigma PLOT9分析软件对数据进行处理，组间比较采用one-way ANOVA，多个实验组与一个对照组比较采用LSD，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
如图1（A，B）所示，COX Ⅳ只存在于各组的线粒体组分中，在各组的胞质组分中均未检测到 COX Ⅳ的免疫活性，提示本实验中的线粒体和胞质成功分离。脑缺血/再灌注组线粒体内Cyt c向胞质的释放与假手术组比较显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。预缺血组与脑缺血/再灌注组相比，线粒体内Cyt c向胞质的释放显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。预缺血前给予MK801组与预缺血组相比，线粒体中Cyt c向胞质释放显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。预缺血前给予生理盐水组相对于预缺血组无明显变化，从而提示NMDA受体介导了预缺血对线粒体中Cyt c向胞质释放的抑制作用。
3讨论
海马CA1区的锥体细胞对于缺血引起的损伤最为脆弱[1]，但是在相对温和的预缺血刺激后，细胞能获得对接下来更为剧烈缺血损伤的耐受，即缺血预适应[4-6]，由于其提供了一种研究内在保护作用机制的途径，故引起广泛关注。NMDAR在神经系统发育过程中发挥着重要的生理作用，如参与调节神经元的存活，神经元树突、轴突结构的发育以及突触可塑性的形成等[9-10]，尽管NMDA受体的过度激活被认为是缺血引起的细胞死亡的主要机制，但是温和地刺激NMDA受体的活性被认为与诱导缺血耐受有关，而其如何导致神经保护作用的细胞信号转导途径还未研究清楚。研究显示，NMDA在海人藻酸诱导的小鼠海马神经元死亡中具有神经保护作用[11]。大量的研究已经证明了NMDA受体在诱导缺血耐受中的关键作用[15]，本研究结果显示，NMDA受体介导缺血耐受对Cyt c从线粒体向胞质释放具有抑制作用。
脑缺血/再灌注导致大脑神经元凋亡，目前其发生机制被认为有以下几个方面：①与凋亡相关基因表达以及许多内外因素的调节有关，如凋亡发生基因的激活；②脑缺血/再灌注后大量氧自由基对神经元造成的严重损伤并诱导了凋亡的发生[16]；③线粒体损伤导致的细胞能量代谢障碍导致凋亡的发生[17]。线粒体中Cyt c的释放是线粒体通路参与脑缺血导致神经元凋亡的重要途径，Cyt c是线粒体内的重要细胞凋亡因子，Cyt c释放后进入胞质，与胞质中Apaf-1和caspase-9形成复合物后激活caspase酶。Apaf/Cyt c复合物又可与ATP/dATP结合并激发其多聚化从而形成凋亡小体，导致细胞凋亡[18]。
本实验通过对大鼠全脑缺血模型的研究来揭示线粒体Cyt c从线粒体向胞质的释放在缺血耐受中的变化，给予SD大鼠3 min缺血作为预缺血，复灌3 d后给予6 min缺血作为致死性缺血，应用NMDA受体抑制剂MK801来探讨NMDA受体在缺血耐受形成中的分子信号机制。本研究结果显示，Cyt c向胞质的释放在缺血复灌过程中有明显升高，而给予预缺血处理使Cyt c向胞质的释放水平明显下降。在预缺血前给予NMDA受体拮抗剂MK801拮抗了预缺血对Cyt c向胞质的释放的抑制作用，这提供了一个直接的证据，证明NMDA受体在诱导缺血耐受中发挥着关键作用，NMDA受体介导了预缺血抑制脑缺血/再灌注诱导增加的Cyt c从线粒体向胞质的释放。
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（收稿日期：2016-05-31 本文编辑：祁海文）