拟南芥PHOT2基因超表达载体的构建及转化
摘要：采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列，并将其转入pSUPER1300超表达载体中，构建了 pSUPER1300-PHOT2 超表达载体，利用农杆菌介导花序转化法，转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。PCR扩增及 RT-PCR 分析表明，该基因超表达，筛选到了潜在的转基因株系。
关键词：蓝光受体；向光素；超表达
中图分类号： Q943.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0030-02
收稿日期：2013-06-08
作者简介：乔新荣（1972—），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究。E-mail：xiong806@163.com。光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的蓝光受体，PHOT1、PHOT2属于同一家族，其N端含有2个高度保守的光感受区LOV1（light，oxygen，voltage1）区、LOV2区，每个LOV区都结合一分子的黄素单核苷酸（FMN）作为发色团。C端是Ser/Thr蛋白激酶区，蓝光激活多个丝氨酸残基发生自磷酸化作用[1]。研究发现，PHOT1的第851位丝氨酸残基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1发挥其生理作用所必需的[2]。PHOT都定位于质膜，但蓝光会诱导部分PHOT1向胞质迁移，部分PHOT2移至高尔基体及叶绿体外膜[3-5]。PHOT1、PHOT2调节植物的许多生理反应，包括植物的向光反应、气孔开放、叶绿体迁移及提高弱光下植物的光合作用、降低强光对植物伤害等[1，6]。目前，学者们对PHOT1、PHOT2的结构及其生理作用有了较为深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光强依赖方式共同介导植物的许多生理反应，如共同介导弱光下叶绿体的聚集运动及强光下下胚轴的向光弯曲[7]。为了进一步研究PHOT2基因的功能及该基因下游的信号调控网络，本研究通过基因重组技术，构建pSUPER1300-PHOT2超表达载体，转入野生型gl1及phot1突变体2种遗传背景材料，获得PHOT2超表达转基因植株，旨在为深入研究PHOT1、PHOT2所调控的信号网络提供遗传材料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料拟南芥野生型gl1（Col-0生态型）、phot1突变体。
1.1.2试剂、菌株、载体大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101、超表达载体pSUPER1300、TaqDNA聚合酶为笔者所在实验室保存；克隆载体pMD18-T 、限制性内切酶、Oligo（dT）引物、核酸分子量标准（marker）、DNA凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自 Invitrogen 公司；高效连接试剂盒Soultion I、M-MLV反转录酶、潮霉素B（hygromycin B）购自Promega公司；KOD-plus DNA 聚合酶购自ToYoBo公司；各类抗生素购自Solarbio公司；dNTP、普通PCR buffer购自天根生化科技有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司（以下简称上海生工）合成（表1）。
1.2方法
1.2.1总RNA提取及cDNA合成将野生型gl1种子点播于0.6% MS固体培养基上，取生长2周左右的无菌苗0.1 g，液氮研磨，按照Trizol试剂说明书提取总RNA 。将提取的总RNA在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。以合格的总RNA 为模板，参照M-MLV反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA 第一链，立即使用或-20 ℃保存备用。
1.2.2AtPHOT2超表达载体构建根据TAIR网站上提供的AtPHOT1的CDS序列及pSUPER1300载体上的多克隆位点，选择XbaⅠ、KpnⅠ限制性内切酶，设计克隆引物PF1、PR1。以cDNA为模板，利用普通TaqDNA聚合酶预扩增预期片段，再用高保真酶KOD-PlusDNA聚合酶扩增回收。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃复性40 s，68 ℃ 延伸3 min，30个循环；68 ℃延伸10 min。依据TA克隆试剂盒说明书将上述PCR 产物克隆到pMD18-T Vector，然后通过热激法将连接产物传入大肠杆菌DH5α中，并在含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB培养基上选择培养。菌落PCR、质粒PCR后，得到重组克隆pMD18-PHOT2质粒，送上海生工测序。以测序正确的pMD18-PHOT2质粒为模板，按上述引物、PCR程序再进行PHOT2片段扩增，回收片段、pSUPER1300 空质粒分别利用XbaⅠ、KpnⅠ酶切，连接并转化，进行PCR检测、酶切鉴定，送上海生工测序，得到pSUPER1300-PHOT2超表达质粒。
1.2.3农杆菌介导的拟南芥遗传转化采用CaCl2冻融法将0.5 μL重组质粒pSUPER13000-PHOT2导入农杆菌GV3101感受态细胞，涂板筛选，挑选单菌落摇菌，以所摇农杆菌菌液为模板，PCR扩增检测阳性目的质粒。拟南芥转化采用的方法是花序浸染法[9]，将含有阳性超表达质粒的农杆菌菌液分别浸染野生型gl1、phot1突变体的花序，收获转化后的种子，用潮霉素B（Hyg B）进行抗性筛选，得T1代转基因植株，用SDS法提取叶片DNA，利用PF2、PR2引物扩增PHOT2基因，对能扩增出目的条带的株系继续进行Hyg B抗性筛选，直至T3代产生纯合株系。
1.2.4表达量鉴定把PHOT2基因转入gl1背景的株系命名为PHOT2-OX，将以phot1突变体为背景的PHOT2超表达株系命名为phot1PHOT2-OX。用Trizol法提取拟南芥gl1、phot1及上述2个转基因株系幼苗的总RNA，利用ACTIN2基因做内参，用PF2、PR2引物对对转基因植株进行PHOT2表达量的半定量PCR鉴定。
2结果与分析
2.1PHOT1基因超表达载体的构建
用Trizol方法提取拟南芥幼苗，用反转录的cDNA为模板，扩增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全长（图1）。由于该基因CDS片段较长，PCR不易扩增，为了保证载体构建时有足够的模板，先将回收的片段与易连接转化的克隆载体pMD18-T相连，将得到的重组产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃培养。通过菌落PCR、质粒PCR鉴定基因片段正确后，取20 μL质粒测序，序列比对完全正确，可用于表达载体构建的模板。用测序正确的质粒为模板，PCR目的条带回收，与pSUPER1300空载体用XbaⅠ、KpnⅠ酶同时酶切4 h回收，Soultion Ⅰ连接酶16 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37 ℃培养。菌落PCR验证正确后，挑单菌落进行过夜液体培养，提取质粒，质粒PCR鉴定条带正确后，再酶切验证（图2）。将得到的pSUPER1300-PHOT2重组质粒送公司测序，经序列比对，序列片段与拟南芥资源信息（TAIR）网站上公布的序列完全相同。
2.2PHOT2超表达转基因植株的初步鉴定
将测序正确的pSUPER1300-PHOT2质粒转入农杆菌GV3101，菌液PCR鉴定出目的条带。将获得的pSUPER1300-PHOT2农杆菌菌株分别浸染拟南芥野生型gl1、phot1突变体植株，筛选转基因株系。取部分T3代纯合株系生长2～3周的叶片，提取基因组DNA进行初步筛选鉴定，设计PHOT2引物PF2、PR2进行PCR检测（图3），检测了5株PHOT2转入野生型gl1所获得的转基因株系（命名为PHOT2-OX），即图3所示的1～5号泳道，除5号株系有微弱条带外，其余均扩增出了较亮的电泳条带，与预期条带一致。6～11号是以phot1突变体为背景的PHOT2超表达株系（命名为phot1PHOT2-OX），7号株系没有目的条带，其他5个株系检测到了目的条带。
2.3PHOT2超表达转基因植株表达量的鉴定
提取图3中有目的条带的转基因单株的总RNA，同时提取野生型gl1及phot1突变体幼苗的总RNA做对照。反转录为cDNA，进行半定量RT-PCR鉴定，检测各个株系PHOT2的表达情况。以ACTIN2为内参，设计表1所示的AF1、AR1为对照引物，PHOT2半定量表达引物为PF2、PR2，进行电泳检测（图4）。PHOT2-OX转基因株系2、3表达量明显高于对照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11号表达量显著高于对照phot1突变体（图5）。由此可知，筛选到了潜在的转基因植株。
3结论与讨论
光不仅是植物生长发育的能量来源，而且也是一种重要的信号分子。利用不同类型的遗传突变体材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介导了植物的许多生理反应，又有其独特的功能。本研究利用优化的PCR反应体系扩增拟南芥PHOT2基因，结果表明，该基因CDS序列全长为2 748 bp，与已发表的PHOT2序列完全相同。将目的基因插入到表达载体pSUPER1300中的35S启动子下游，成功构建了超表达质粒pSUPER1300-PHOT2，获得了野生型gl1、phot1突变体2种背景的PHOT2超表达遗传材料。
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