苦参功劳颗粒对人工感染鸡大肠杆菌病的临床疗效研究
计划，给养殖业大肠杆菌病防控带来新的挑战。苦参功劳颗粒是按传统中兽医理论开发的中兽药复方制剂，由十大功劳、苦参、木香3味药物组成，药效学研究表明苦参功劳颗粒对人工感染大肠杆菌的小鼠具有治疗作用[6]。为了考察苦参功劳颗粒对鸡大肠杆菌病的临床治疗效果，笔者采用人工感染疾病模型进行临床效果评价。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品。 苦参功劳颗粒，批号20140401，规格为每1 g相当于原生药3 g，购自洛阳惠中兽药有限公司;四黄止痢颗粒，批号为20130901，规格为100 g∶100 g（原生药），购自普莱柯生物工程股份有限公司。
1.1.2 供试菌株。 O78型鸡大肠杆菌C83851，购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心。
1.1.3 主要试剂。 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，均购于青岛高科园海博生物技术有限公司;氯化钠购自天津市风帆化学试剂科技有限公司。
1.1.4 主要仪器。 DT1000天孚牌电子天平，为常熟市金羊砝码仪器有限公司产品;核酸蛋白测定仪，型号6132型，为德国Eppendorf公司产品;全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，YXQ-LS-100A型，为上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品;生物安全柜，Nu-425-400S型，为美国Nuaire公司产品;电热恒温培养箱，DNP-9272BS-Ⅲ型，为上海新苗医疗器械制造有限公司产品;恒温摇床，HHWY-200型，为常州诺基仪器有限公司产品。
1.1.5 试验动物。 1日龄健康海兰褐壳蛋公雏300只，由洛阳市畜康牧业公司提供。
1.2 方法
1.2.1 试验菌液的制备。 取大肠杆菌C83851的第2代甘油保存物，接种于10 mL营养肉汤中，37 ℃、150 r/min振荡培养16 h进行复壮;用接种环挑取新鲜菌液划线接种于营养琼脂平板上，37 ℃培养16 h进行菌种纯化。从纯化后的琼脂板上取典型单菌落6个接种于100 mL营养肉汤中，37 ℃、150 r/min振荡培养12 h进行增菌培养，备用。
使用时，取增菌培养的菌液进行10倍稀释后，以营养肉汤为空白對照，测定600 nm波长处的OD值，并添加营养肉汤调节OD值为0.34～0.36，此时菌液浓度为2.5×108 CFU/mL。根据稀释时加入肉汤的量，估测原菌液的浓度为3.0×109 CFU/mL，并根据估测结果，将菌液进行6倍稀释，此时菌液浓度约为5.0×108 CFU/mL。
1.2.2 动物分组。 取1日龄健康雏鸡240只，正常饲养18 d后随机分为6组，每组40只，分别为健康对照组、攻毒对照组、苦参功劳颗粒低剂量组、苦参功劳颗粒中剂量组、苦参功劳颗粒高剂量组和对照药物组。
1.2.3 人工感染鸡大肠杆菌模型的建立。健康对照组雏鸡胸肌注射0.2 mL营养肉汤，另外5组进行攻毒，雏鸡胸肌注射0.2 mL浓度约5.0×108 CFU/mL的大肠杆菌菌液。攻毒的同时将上述菌液进行10倍系列稀释至107倍，分别取106倍、107倍稀释的菌液0.1 mL，滴加于营养琼脂平板表面，涂抹棒涂抹均匀，进行活菌计数，计算攻毒用菌液的实际浓度。
1.2.4 模型判定标准。攻毒后4 h，逐只观察鸡群发病情况，当感染模型符合如下标准则判断模型建立成功。临床症状如下：鸡只出现精神沉郁、耷尾拖翅、闭眼缩颈、腹泻或肛周有粪便污染等。病理剖检：死亡剖检发现病鸡可见典型的心包炎、肝周炎等纤维素渗出炎症。病原分离：无菌操作条件下采集死亡鸡只心脏、肝脏样品，接种于麦康凯培养基，37 ℃过夜培养后挑出粉红色、光滑的单个菌落接种于伊红美蓝培养基上，37 ℃过夜培养，若出现有金属光泽的菌落则鉴定为鸡大肠杆菌。
1.2.5 苦参功劳颗粒对人工感染鸡大肠杆菌病的疗效试验
1.2.5.1 给药。 攻毒后4 h试验各组按表1给药方案开始给药，给药前苦参功劳颗粒高、中、低剂量组预先用纯化水配成浓度分别为140、70、35 mg/mL的溶液，四黄止痢颗粒配成浓度为70 mg/mL的溶液，各组采用灌胃方式进行给药，给药量0.5 mL/只，连续给药5 d。
1.2.5.2 疗效观察。每天观察鸡只的临床症状，连续观察19 d，并针对精神状态、行为活动、被毛状态、釆食行为进行计分，每项分3～4个级别，具体评分标准见表2。
1.2.6 疗效评价标准。
1.2.6.1 增重率。试验过程中，试验前称取各组鸡只的始重，试验结束时称取各组鸡只末重，根据始重与末重，计算试验期间各组鸡群的增重率。
增重率=其他组平均末重-其他组平均始重健康对照组平均末重-健康对照组平均始重×100%（3）
1.2.6.2 死亡率。 试验期间的死亡鸡只，解剖后有心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎等典型症状，取肝脏、心脏经麦康凯琼脂培养有大肠杆菌生长者判为发病死亡，根据各组发病死亡动物数与该组动物总数，计算死亡率。
死亡率=各组死亡动物数该组动物总数 ×100%（4）
1.2.6.3 治愈率。试验期间给药组鸡只接受治疗后，临床症状消失，试验结束时解剖无心包炎、肝周炎、腹膜炎、气囊炎等典型症状，取肝脏、心脏经麦康凯琼脂培养无大肠杆菌生长，判为治愈。根据各组治愈动物数与该组动物总数，计算治愈率。
治愈率= 各组治愈动物数该组动物总数×100%（5）
1.2.7 数据统计与分析。
发病率、治愈率等数据以百分数表示，采用卡方检验对试验数据进行分析;体重以平均值±标准差表示，组间用t检验进行比较;各组间显著性用P值表示，其中0.01<P≤0.05表示差异显著，P≤0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 人工感染鸡大肠杆菌病模型建立的结果 攻毒后4 h，各攻毒组鸡群均出现发病症状，发病率达100%，发病鸡表现精神沉郁、被毛散乱、耷尾拖翅、饮食废绝等鸡大肠杆菌病的典型症状，健康对照组鸡群在整个试验期间未出现任何异常，判断攻毒模型成立。试验期间死亡鸡只剖检发现肝脏、心脏表面明显的纤维素性渗出，病源分离结果显示伊红美蓝培养基上出现典型大肠杆菌。根据活菌计数结果，选试验中攻毒所用的菌液实际浓度为5.2×108 CFU/mL。
2.2 苦参功劳颗粒治疗对病鸡增重率的影响 将试验前19日龄分组时称取的鸡只体重作为始重，试验结束时即38日龄的体重作为末重，计算增重率，结果见表3。从表3可以看出，试验开始时各组鸡群初体重无显著差异（P>0.05），试验结束时攻毒各组平均体重极显著低于健康对照组（P≤0.01），说明感染鸡大肠杆菌后鸡只增重减慢。但给药各组试验结束时末重均高于攻毒对照组;试验期间增重率亦高于攻毒对照组。就试验结束时末重而言，苦参功劳颗粒高剂量组显著高于攻毒对照组（0.01<P≤0.05），中剂量组极显著高于攻毒对照组（P≤0.01）;苦参功劳颗粒低剂量组、四黄止痢颗粒对照组与攻毒对照组间无显著差异（P>0.05）。这说明苦参功劳颗粒按0.2、0.4 g/kg剂量使用在一定程度上可以改善鸡群感染大肠杆菌所造成的生长发育受阻。
2.3 苦参功劳颗粒对病鸡临床症状的影响 根据症状计分结果，以第1、3、5、7、9、11、13、15和19天观察症状百分率并绘图，结果见图1。
从图1可以看出，第3天（即苦参功劳颗粒连续灌胃2 d），各组鸡只的症状评分百分率均较高。第5天，由于鸡群发病后鸡只死亡，攻毒对照组症状评分百分率与第3天相比出现轻微下降。给药各组由于给药的影响，症状评分百分率急剧下降，攻毒后第7天已经降至相对较低的水平，攻毒第9天鸡只完全痊愈，而攻毒对照组第13天症状才完全消失，症状评分百分率为0。这说明苦参功劳颗粒可以缓解大肠杆菌的发病症状，减轻发病程度，并能促进机体快速康复。
2.4 苦参功劳颗粒对人工感染鸡大肠杆菌病治愈率和死亡率的影响 从表4可以看出，攻毒对照组死亡率为47.5%，给药各组经过药物治疗后死亡率均有不同程度的降低。与攻毒对照组相比，苦参功劳颗粒低剂量组、四黄止痢颗粒对照组死亡率显著降低（0.01<P≤0.05），苦参功劳颗粒中、高剂量组死亡率极显著降低（P≤0.01）。苦参功劳颗粒低、中、高剂量组和四黄止痢颗粒对照组的治愈率分别为67.5%、77.5%、80.0%和72.5%，相对于攻毒对照组的自愈情况，各给药组的治愈率极显著高于攻毒对照组的自愈率（P≤0.01）。这说明鸡只感染大肠杆菌病后，灌胃给予苦参功劳颗粒和四黄止痢颗粒可以降低鸡只发病引起的死亡。
3 结论与讨论
（1）大肠杆菌C83851新鲜培养物按5.2×108 CFU/mL的剂量胸肌注射0.2 mL可以成功建立鸡大肠杆菌病模型，攻毒4 h后鸡只出现典型的大肠杆菌病临床症状，且通过剖检和病原分离确认为大肠杆菌感染。试验结束对病鸡解剖发现，心包炎的发生率高于肝周炎，可能与大肠杆菌C83851株对对心脏的亲嗜性强有关。该试验建立的鸡大肠杆菌感染模型的临床症状与文献[7-9]相一致。
（2）研究表明，中药苦参提取物具有明显的抗菌作用，对多种致病菌有效[10-11]。该研究中苦参功劳颗粒按0.1、0.2、0.4 g/kg体重灌胃给药，连续5 d，可以明显降低大肠杆菌感染鸡只的死亡，3个剂量组的治愈率分别为67.5%、77.5%和80.0%。应用苦参功劳颗粒治疗后能缓解发病症状，减轻发病程度，促使机体快速康复，体重增重率分别为56.91%、63.56%和61.36%，表明其对大肠杆菌病引起的鸡只生长发育受阻具有改善作用。因此苦参功劳颗粒按推荐剂量0.2 g/kg（混饮，每升水加1.0 g）使用，连续5 d，对鸡大肠杆菌病具有良好的治疗作用。
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