高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens ,EHA105菌株)介导法,对平菇(Pleurotus ostreatus)菌丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究,结果表明:当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20 min,且与农杆菌共培养60 min时,转化效率高且用时较少。经PCR和Southern Blotting检测表明,转移DNA (transferred DNA,T DNA)中的潮霉素抗性基因hph已整合到转化子基因组中。

平菇; 根癌农杆菌; hph基因; 高渗; 共培养

平菇(Pleurotus ostreatus)作为一种食用真菌,在我国得到广泛栽培,但是由于平菇品种长期无性繁殖致使菌种退化、产量降低,而传统的育种技术存在着周期长、见效慢、不稳定等问题,因此迫切需要探索更高效、稳定的育种方法。基因工程技术的发展为菌种选育开辟了一条新途径, 1998年,DE GROOT等首先把农杆菌介导法应用于真菌的遗传转化,以真菌的分生孢子和菌丝为受体,成功地将T DNA转入泡盛曲霉(Aspergillus awamori )、哈茨木霉(Trichoderma harziamum )、粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)和双孢菇(Agaricus bisporus)中[1];CHEN等利用改进的农杆菌介导法对双孢菇子实体进行转化并获得成功[2];2001年,THOMAS等同样用农杆菌转化了双孢菇的菌丝体和担孢子萌发菌丝,获得了稳定的转化子[3];但上述方法中转化效率相对较低,获得的转化子大部分不稳定。在传统的基因枪遗传转化方法中,许多植物及外植体在轰击转化前经渗透处理都有助于提高转化效率[4 7],因此,山东省应用微生物重点实验室通过对平菇菌丝体进行高渗处理以及与农杆菌共培养时间等条件的探索,筛选出平菇菌丝体转化的最佳条件。

1 材料和方法

1.1供试菌株与质粒

平菇(Pleurotus ostreatus)菌株LZ-2由山东省农业科学院万鲁长老师赠送; 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )EHA105菌株由中国农业大学张力群老师惠赠;含有潮霉素抗性基因hph的质粒pCAMBIA1302由山东省应用微生物重点实验室保存。

1.2培养基

PDA培养基(/L):马铃薯 200 g,葡萄糖15 g,琼脂 15 g。

PDA选择培养基(/L):PDA培养基中加入不同浓度的潮霉素(Sigma公司)。

LB液体培养基(/L):胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母提取物 5 g,pH 7.0～7.5。

LB固体培养基(/L):LB液体培养基中加入15 g 琼脂。

LB诱导培养基(/L):LB液体培养基中加入乙酰丁香酮(AS,溶于二甲基亚砜中,工作浓度为200 μmol/L)。

共培养诱导培养基(/L):葡萄糖 5 g;K2HPO4 0.5 g;MgSO4•7H2O 0.2 g;CaCl20.2 g;谷氨酸 0.05 g; NaCl 0.02 g;EDTA铁钠盐0.066 g;Na2MoO4 0.002 g;琼脂 20 g;pH 7.2～7.4。使用前加入溶于二甲基亚砜的AS, 工作浓度为200 μmol/L。

1.3潮霉素适宜筛选浓度的确定

将平菇菌株在PDA平板上25 ℃培养5 d进行活化,然后分别接种于含有50 、60、70 、80 、90 、100 、200 μg/mL潮霉素的PDA平板,以不含潮霉素的PDA平板为对照,置于28 ℃恒温培养箱培养,每天观察菌丝生长情况,以筛选PDA中添加潮霉素的适宜浓度。

任 艳,等:高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

1.4根癌农杆菌介导的遗传转化

1.4.1农杆菌的活化与诱导

通过冻融法将质粒pCAMBIA1302转化到农杆菌EHA105中[8],将菌液涂于LB平板上(含有100 μg/mL卡那霉素),28 ℃倒置培养,2 d后挑取农杆菌单菌落,接种于5 mL LB液体培养基中,200 r/min、28 ℃过夜培养。次日,按1%的接种量将过夜培养的菌液接种到新鲜的LB诱导培养基中,28 ℃培养5～6 h至OD600达到0.5～0.6。

1.4.2高渗处理菌丝材料

按常规方法将平菇接种于PDA平板,25 ℃培养5 d,选择菌落边缘生长均匀的菌丝,用打孔器选取直径约0.5 cm的菌块,为改变细胞内外渗透压,每150片菌块浸泡于300 mL的0.1 mol/L甘露醇和0.2 mol/L山梨醇等体积混合液中。将与混合液的作用时间设20、40、60 min 3个处理。处理完毕后将菌丝体表面的水分用无菌滤纸充分吸干。

1.4.3与农杆菌共培养时间筛选

取1.4.1处理后的含有pCAMBIA1302质粒的EHA105菌液10 mL,分别与1.4.2中不同时间处理的菌块充分混合,28 ℃、150 r/min进行共培养,时间设20、40、60 min 3个处理,每处理设3次重复。

1.4.4转化子的筛选

将经过共培养的菌块接种于共培养诱导培养基上,28 ℃培养2 d,然后向其中倒入一层约15 mL的PDA选择培养基,28 ℃继续培养,每天观察菌丝生长情况,及时挑取新生菌丝(为避免重复,每个平菇菌块挑取一次),并再次转接到PDA选择培养基平板上,连续培养7 d,正常生长的平菇菌丝体为转化子,统计各处理组转化子数量。用SPSS统计软件进行数据分析。

1.4.5转化子的稳定性检测

转化子在普通PDA平板上连续转接15代后再接入到PDA选择培养基平板上,观察菌丝生长状况,与普通PDA平板上菌丝生长一致的是可稳定遗传的转化子。

1.4.6转化子的分子检测

1.4.6.1 PCR鉴定

按文献[9,10]的方法提取3个抗性稳定的转化子总DNA,以其为模板, 以HPH F:5’CCGGTTTCCACTATCGGCGA3’HPH R:5’CAAAGCCTGAACTCACCGC3’为引物(由上海生工生物工程有限公司合成)扩增T DNA中潮霉素抗性基因hph,以非转化子为阴性对照,以质粒pCAMBIA1302为阳性对照。PCR反应体系为:25 μL反应体系中加1.0 μL DNA,2.5 μL 10×PCR缓冲液,2.0 μL 2.5 mmol/L dNTP, 0.2 μL 0.5 mmol/L Taq DNA聚合酶,10 μmol/L引物各1.5 μL,16.3 μL ddH2O。

PCR反应条件为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1min,58 ℃ 复性1 min,72 ℃ 延伸2 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物采用0.8%琼脂糖进行凝胶电泳检测,凝胶成像系统照相。

1.4.6.2 Southern blotting分子杂交

选择3个平菇转化子进行Southern blotting分子杂交检测。

潮霉素抗性基因hph的制备:以pCAMBIA1302 质粒为模板,HPH F 和HPH R作为引物,扩增潮霉素抗性基因hph,然后回收纯化PCR产物用以制备探针。

突变体基因组DNA酶切电泳:以限制性内切酶EcoRI酶解质粒pCAMBIA1302为阳性对照,以原始菌株为阴性对照,利用EcoRI酶切平菇转化子和非转化子的总基因组DNA,酶解产物用0.8%琼脂糖在20 V电压下电泳过夜。DNA从凝胶中转移至尼龙膜的步骤根据文献[11]的方法进行。hph基因片段探针标记,膜的预杂交、杂交、洗膜、显色等步骤均按Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Fermentas公司)说明书进行。

2 结果与分析

2.1潮霉素适宜筛选浓度的确定

检测结果表明,潮霉素对平菇菌丝体的生长速度有较大影响,当浓度为30 μg/mL时,菌丝生长缓慢;当浓度为50 、70 μg/mL时,菌丝生长受到抑制;当浓度为100、200 μg/mL时,菌丝停止生长。为了降低转化子的假阳性率,在平菇转化实验中,选取200 μg/mL潮霉素作为PDA选择培养基的筛选浓度。

2.2高渗处理和共培养时间对转化子数目的影响

高渗处理平菇菌丝体时间和菌丝体与农杆菌共培养时间对转化子数量有不同程度的影响,结果见表1。

9个处理中,1、2菌丝体与农杆菌的共培养时间少于60 min,农杆菌未能与菌丝体进行充分有效的结合,转化子数量较少;4、5中,由于菌丝体预处理时间较长,虽然与农杆菌作用时间不足60 min,但在渗透压作用下转化子数量较多;7、8、9由于菌丝体处理时间过长,导致细胞发生不可恢复性死亡,转化子数量最少。3与6得到的转化子数量最多,两者之间无差异,但是3的总用时80 min比试验6的100 min短,所以3为最佳转化条件。

表1 高渗处理和共培养时间对转化子数目的影响

Table 1 Effect of different hyper osmosis and co cultivation treatments on transformant production

编号

Sample高渗处理菌丝体时间

Hyper osmosis treatment

period (min)与农杆菌共培养时间

Co cultivation period with

A. tumefaciens(min)转化子数

No. of transformants

120203.33±0.33 bc AB

220403.33±0.88 bc AB

320607.00±0.58 d C

440204.33±0.88 c B

540404.33±0.33 c B

640607.67±0.33 d C

760201.33±0.33 a A

860401.67±0.33 ab A

960602.00±0.58 ab AB

数据为3次实验平均值±SD;大小写英文字母表示P<0.01或P<0.05的差异显著性

Values shown represent the means of three replicates ±SD; Different lower and higher case letters represent significant differences at P 0.05 and P 0.01, respectively.

2.3转化子的稳定性

随机选取的10个转化子经15次传代后其菌丝生长状况与在PDA平板上菌丝生长一致,因此这些转化子都是可稳定遗传的。

2.4对转化子的分子学鉴定

2.4.1PCR鉴定结果

平菇转化子基因组DNA中潮霉素抗性基因hph的PCR检测结果见图1, 从10个稳定遗传的转化子中选取的3个转化子,均可以扩增出大小约为1.2 kb的片段(第2～4泳道),而以未转化的原始菌株DNA为模板扩增,没有条带出现(第1泳道),初步证明hph基因插入到转化子染色体基因组内。

2.4.2Southern blotting分子杂交检测

平菇转化子的Southern杂交结果见图2,3个转化子样品中均产生了杂交带(第3～5泳道),而阴性对照(非转化子)未产生任何杂交信号(第1泳道),阳性对照质粒产生了与hph探针杂交信号带(第2泳道),这证明了hph基因已整合到转化子基因组中。

泳道M:分子量标记;泳道1:阴性对照(非转化子);泳道2～4:平菇转化子;泳道5:阳性对照(质粒)

Lane M:markers; lane 1: negative control (non transformant); lane 2～4: P. ostreatus transformants;5: positive control (plasmid)

图1 平菇转化子基因组DNA中潮霉素抗性

基因PCR检测结果

Fig.1 PCR detection of a hygromycin resistance gene in

P. ostreatus transformants

1:阴性对照(非转化子);2:阳性对照(质粒);3~5:平菇转化子

1: Negative control (non transformant);2: positive control (plasmid); 3～5: P. ostreatus transformant

图2 平菇转化子的Southern杂交

Fig.2 Southern blotting of P. ostreatus transformant

3 结论与讨论

本试验研究结果表明,当平菇菌丝体高渗处理20 min、与农杆菌共培养60 min时,转化效率高且用时较少,为根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的最佳转化条件。本研究中平菇菌丝体的高渗处理和与农杆菌共培养是关键步骤,这可能是由于高渗处理后细胞内外形成压力差,细胞发生质壁分离,液泡变小,此时再与充分诱导的农杆菌混合,能有效的促使农杆菌吸附在细胞表面,并借助此压差更易转入到平菇菌丝细胞内,从而提高转化效率。

以后工作中我们将对不同渗透剂进行浓度梯度处理,改变溶液渗透压,研究压差与转化结果的关系。

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