百合转录辅激活因子LIMBFlc基因的克隆与表达分析
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摘要：为了深入研究百合响应高温胁迫的分子机制，本研究以麝香百合杂种系品种白天堂为试验材料，从中分离得到1个MBFle基因，其开放阅读框为438bp，编码145个氨基酸，蛋白质分子量为15900，理论等电点为10.22。多序列同源比对和进化树分析表明百合MBFle具有典型的MBF1和HTH结构域，归属c亚型MBF1，因此将克隆到的基因命名为LIMBFle。亚细胞定位结果表明，LIMBFle可能介导了热激信号由细胞质向细胞核的转导。实时荧光定量PCR分析结果表明，LIMBFle在叶中的表达量最高，根中次之，鳞茎中最低;LIMBFle的表达受热激诱导。表明，LIMBFle基因可能与百合的热激反应密切相关。
关键词：百合;MBF1;基因克隆;亚细胞定位;表达分析
中图分类号：Q785
文献标识码： A
文章编号： 1000-4440（2018） 05-1120-08
百合（Lilium spp.）为百合科百合属球根花卉，具有重要的观赏、食用和药用价值。百合性喜冷凉、湿润气候，耐热性较差，然而中国大部分地区夏季炎热，高温造成百合生长停滞、植株矮小、少花盲花、茎秆软、病虫害严重等现象，严重影响切花的产量和质量，并造成种球退化，制约着中国百合商品化周年生產。所以，提高百合耐热性是解决这一问题的关键。在百合野生种中，麝香百合（Lilium longiflorumThunb）和台湾百合（Lilium formosanum Wallace）的耐热性较强，它们的杂交品种也具有较强的耐热性。因此，解析耐热百合品种的高温逆境响应机制，鉴定调控耐热性的关键基因，对于采用基因工程技术来提高百合的耐热性具有重要的理论和实践意义。
目前的研究结果表明，植物响应高温胁迫的调控途径主要有：热激转录因子一热激蛋白（HSF-HSP）途径、钙离子一钙调蛋白（Ca2+_CaM）途径、活性氧（ROS）途径、激素调控途径、细胞未折叠蛋白响应（UPR）途径和核小体介导途径。细胞内的这些调控途径相互交叉组成了植物的热激信号转导网络。近年来，植物多蛋白桥梁因子（Multiprotein bridgingfactor lc.MBFlc）被鉴定为调控植物耐热性的重要转录调节因子。MBFlc又称转录辅激活因子（Tran-scriptional Co-activator），可以连接通用转录因子TBP（TATA-box Binding Protein）和基因特异性转录因子，从而增强特异性转录因子的DNA结合活性，最终促进靶基因的表达。研究发现，MBFlc涉及通过激素、HSF-HSP、ROS和Ca2+信号途径调控植物的耐热性，是植物热激信号转导网络的关键节点。
本研究以耐热性较好的麝香百合杂种系品种白天堂（L.lon，giflorum cv.White Heaven）为试验材料，从中克隆了MBFlc基因，分析百合MBFlc蛋白特性及MBFlc基因在热胁迫下的表达模式，以期为进一步研究MBFlc基因在百合耐热性调节方面的功能及作用机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为麝香百合杂种系品种白天堂组培苗，培养条件为22℃，光照时间为16h/d。亚细胞定位使用的材料为紫皮洋葱（Allium cepa）。
RNA提取试剂盒、大肠杆菌感受态DH5a购自北京天根生化科技有限公司，DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司.5"-Full RACE kit、pMD18-T载体、M-MLV逆转录试剂盒、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶等购自TaKaRa公司，荧光定量试剂盒SYBRFAST qPCR Universal Kit购自KAPA公司，氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）购自Sigma公司，其他常规试剂均为进口或国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（试验所用引物见表1）;DNA测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1.2 试验方法
1.2.1 LIMBFlc全长cDNA克隆 用37℃热激处理百合组培苗2h，然后取0.1g叶片用液氮研磨提取RNA。RNA的提取根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行。用NanoDrop 2000 Spectro-photometer（Thermo，USA）检测吸光值（A260/A 230和A260/A280）判断RNA的质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成根据TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）说明书进行，反转录接头引物为AP。
基因保守片段的克隆：根据GenBank数据库中报道的其他植物MBFlc mRNA序列，通过DNAman5软件进行同源比对，设计保守区兼并引物。以反转录的cDNA为模板，利用巢式PCR扩增中间保守片段，第一轮引物为DPF1（上游）和DPR1（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s，57℃ 30 s，72℃40s，33个循环;72℃10 min。取1μ1产物作第二轮反应的模板，第二轮引物为DPF2（上游）和DPR2（下游），反应程序为：94℃5 min;94℃30s.58℃30 s.72℃ 30 s，33个循环;72℃10 min。
基因3’端序列的克隆：通过RACE（Rapid Am-plification of cDNA Ends）的方法获得目的基因的3’端序列。以cDNA为模板，根据已经克隆的目的基因保守片段设计2条上游特异引物，分别与下游的3’接头引物进行PCR扩增。第一轮引物为SPF1和AP1，反应程序为：94℃5 min;94 0C 30 s.63℃30s，72℃1 min，33个循环：72℃10 min。第二轮引物为SPF2和AP2，反应程序为：94℃5 min; 94℃30 s，62℃ 30 s，72℃50 s，33个循环;72℃ 10min。
基因5’端序列的克隆：按照TaKaRa公司5’-FullRACE kit说明书进行，用Random 9 mers引物进行反转录。根据已經获得的目的基因片段设计2条下游特异引物SPR1和SPR2，与试剂盒自带的2条5’端接头引物进行巢式PCR扩增。第一轮PCR扩增引物为5"RACE Outer primer和特异引物SPR1，反应程序为：94℃5min;94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 50 s，25个循环：72℃10 min。取第一轮产物1μl进行第二轮反应，引物为5’ RACE Inner primer，特异引物为SPR2，反应程序为：94℃5min;94℃ 30s.62℃30s，72℃ 40s，33个循环：72℃ 10min。
开放阅读框（Open reading frame，ORF）序列的校正：将已经获得的目的基因5’片段、中间片段和3’片段用DNAMAN 5拼接，并在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上预测其ORF，在起始密码子上游设计特异引物SPF3（上游），在终止密码子下游设计特异引物SPR3（下游），用保真性较高的TaKaRaPrimeSTAR@HS DNA Polymerase扩增目的基因的ORF序列。反应程序为：94℃ 5min;94℃ 30s，55℃30s，72℃40s，33个循环;72℃10min。
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，连接到pMD18-T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中，Amp抗性培养基过夜培养后，挑取单克隆进行菌落PCR检测，将含有目的基因片段的阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。
1.2.2 LIMBFlc的生物信息学分析用Primer Prem-ier 5软件将目的基因的ORF序列翻译成氨基酸序列;用EXPASY （https：//www.expasy.org/tools/）中的ProtParam、SMART、SignalP、TMHMM、PSORT等工具对氨基酸序列进行生物信息学分析：用NCBI的BLAST功能和DNAMAN 5对LIMBFlc进行多重比对分析：用MEGA 5软件构建系统进化树。
1.2.3 LIMBFlc的亚细胞定位 利用DNAMAN 5分析LIMBFlc的ORF序列的酶切位点，结合pCAM-BIA1300载体，选用Sal I和Spe I作为融合表达载体构建的酶切位点，并设计上游特异引物SPF4和下游特异引物SPR4进行PCR扩增。双酶切pCAM-BIA1300空载质粒和PCR扩增产物，纯化酶切产物并用T4连接酶连接，获得pCAMBIA1300-LlMBF/c-GFP重组表达载体，双酶切和测序验证连接是否成功。用基因枪轰击法将构建好的pCAMBIA1300-LiMBF/c-GFP重组表达载体轰击到在MS培养基上预培养24h的洋葱表皮细胞中，分别置于22℃和37℃暗培养24 h，空载pCAMBIA1300-GFP作为对照。用激光共聚焦显微镜（Nikon Eclipse TE2000-E）观察和拍照，并用EZ-C1软件分析和处理照片。
1.2.4
LIMBFlc的表达分析选择生长良好、长势一致的白天堂组培苗作为基因表达分析的材料。
LIMBFlc在不同组织中的表达：分别取常温（22℃）培养的百合组培苗的根、鳞茎和叶片。LIMBFlc在不同热激时间下的表达：用37 cC热激百合的组培苗，分别在处理0.5h、1.0h、2.0h、4.0h和8.0h时取叶片，以常温（22℃）为对照。LIMBFlc受Ca2+处理的表达：分别在22℃、37 cC条件下，用20 ml 20mmol/L CaCl，、10 mmol/L EGTA溶液浸没百合组培苗根系2.0 h后取叶片，用去离子水处理作为对照。
所取组织用液氮速冻并保存于-80 cC的超低温冰箱中备用提取RNA，RNA的提取与反转录方法同方法1.2.1。采用荧光定量PCR（Real-time fluores-cence quantitative PCR，qPCR）的方法检测基因的表达，LIMBF lc的扩增引物为qFl和qRl，内参基因18S RNA的扩增引物为18S qF和I8S qR。试验参照SYBR FAST qPCR Universal Kit荧光定量试剂盒说明书进行，仪器为Applied Biosystems Step Onesystem PCR仪。反应程序为：95℃3 min;95℃3s，55℃30 s，72℃20s，40个循环。每个样品重复3次。采用2-△△方法分析基因的相对表达量，用Excel 2003和SPSS 18软件分析数据。
2 结果与分析
2.1 百合LIMBFlc的cDNA全长克隆
通过同源克隆的方法获得目的基因的中间保守片段序列，通过RACE的方法获得目的基因的3"端和5’端序列，利用DNAMAN 5拼接得到全长为620bp的序列，其中ORF区序列长为438 bp，编码145个氨基酸（图1）。BIAST的结果显示，该基因与其他物种的MBFlc基因有较高的同源性，将其命名为LIMBFlc。
2.2 百合LIMBFlc蛋白的生物信息学分析
ProtParam在线工具预测百合LIMBFlc蛋白包含145个氨基酸残基，分子式为C696H1182N2160201S3，分子量为15900。亲水性平均系数（GRAVY）为-0.47（<0），属于亲水蛋白，不稳定系数为36.12（<40），属于稳定蛋白，半衰期在大肠杆菌（Escherichiacoli）中大于10 h，在酵母菌（Saccharomyces cerevisi-ae）中大于20 h。氨基酸组成成分分析结果表明，LIMBFlc肽链负电荷残基（天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu）为16，正电荷残基（精氨酸Arg+赖氨酸Lys）为29，理论等电点（ P/）为10.22，属于碱性蛋白。蛋白质信号肽预测程序SignalP预测分值为0.1l（<0. 50），表明LIMBFlc不含信号肽。蛋白跨膜区域预测软件TMHMM未发现LIMBFlc有明显的跨膜区域，蛋白质亚细胞定位工具PSORT预测LIMBFlc主要定位于细胞质、细胞核内。将LIMBFlc与拟南芥（Arabidopsis thalian，a）、芜菁（Brassica rapa）、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、葡萄（Vitisvinifera）的MBFlc氨基酸序列进行同源比对，结果（图2）表明，LIMBFlc蛋白与其他物种的MBFlc蛋白类似，在靠近N端11—81个氨基酸残基内含有1个典型的MBF1结构域，在靠近C端部分（88～ 143aa）含有1个α螺旋一转角-α螺旋（Helix-Tum-Helix，HTH）结构域。
将百合LIMBFlc和其他植物的MBF1氨基酸序列，用MEGA 5构建系统进化树，结果（图3）显示MBF1家族有2个分枝，第1類MBFl（Group I）包括a亚型（Subtype a）与b亚型（Subtype b）;c亚型（Subtype c）与a、b亚型相似度较低，归属第Ⅱ类MBFl（GroupⅡ）。百合LIMBFlc归属于c亚型，与油棕（Elaeis guineensis）的亲缘关系最近，BLAST的结果显示相似度达79%。
2.3 百合LIMBFlc亚细胞定位
利用基因枪将构建好的重组表达载体pCAM-BIA1300-LIMBFlc-GFP轰击到经过24h预培养的洋葱表皮细胞中，分别置于常温、热胁迫条件下暗培养24h后放置于激光共聚焦显微镜下观察。结果（图4）表明，常温下，空载对照pCAMBIA1300-GFP的绿色荧光分布在细胞膜、细胞质和细胞核中;热胁迫下，绿色荧光的分布无明显变化。常温下，pCAMBIA1300-LIMBF/c-GFP的绿色荧光分布在细胞质和细胞核中;热胁迫下，pCAMBIA1300-LIMBFlc-GFP的绿色荧光则主要分布在细胞核中。表明LIMBFlc可能介导了热激信号由细胞质向细胞核的转导，并在细胞核内进一步行使功能。
2.4 百合LIMBFlc的表达分析
利用实时荧光定量PCR检测了LIMBFlc的时空表达。结果表明，常温条件下，LIMBFlc在百合根、鳞茎和叶中均有表达，其中叶中的表达量最高，根中次之，鳞茎中最低（图5）。热激处理后，在0.5～8.0h内百合叶片中LIMBFlc的相对表达量呈现出先上升后下降的趋势，但始终高于对照，在热激处理2h时达到峰值，为对照的5.53倍（图6）。常温条件下，与对照相比.CaCl2或EGTA处理的//MBFlc的相对表达量差异不显著（P>0.05）。37℃热胁迫下，CaCl，处理显著促进了LIMBFlc的表达（P<0.05），而EGTA处理则显著抑制了LIMBFlc的表达（P<0.05）（图7），表明LIMBFlc也可能通过Ca2+信号途径参与百合的热激反应。
3 讨论
目前，有关百合的耐热研究主要集中在以下几个方面：（1）百合对高温胁迫的形态和生理响应。（2）百合种质耐热性比较。（3）利用物理、化学方法或杂交育种途径提高百合的耐热性[18-23]。（4）百合响应高温胁迫的分子机制。百合LIHSFA1、LIHsfA2、LIHSP70、LimHSP16.45的表达受高温诱导，在拟南芥中过表达这些基因显著提高了植株的耐热性。百合钙调蛋白LICaM3为响应Ca2+和热胁迫的重要信号分子，Ca2+/LICaM3可能在HSFA1的上游发挥作用。尚爱芹等利用农杆菌介导的方法将拟南芥干旱应答元件结合蛋白At-DREB2A（Dehydration responsive element binding pro-tein 2A）基因转化百合，高温胁迫下，转基因植株的POD、SOD等酶活性及脯氨酸含量高于野生型植株，耐热性明显强于野生型植株。以上的研究结果表明ROS、SA、HSF-HSP和Ca2+信号途径均参与了百合耐热性的调控。近年的研究结果表明，转录辅激活因子MBF1涉及通过激素、HSF-HSP、ROS和Ca2+信号途径调控植物的耐热性，是植物热激信号转导网络的关键节点，在植物耐热性的转录水平调控中发挥重要作用。根据氨基酸序列的不同，植物中的MBF1可分为a、b、c3个亚型.a亚型与b亚型相似度较高，归属第1类MBFl;c亚型与a、b亚型相似度较低，归属第Ⅱ类MBFl。与I类MBF1相比，Ⅱ类（c亚型）MBF1在植物耐热性的调控中起主要作用。因此，我们选择植物热激信号转导网络的可能整合因子MBFlc作为研究对象。本研究以耐热性较好的麝香百合杂种系品种白天堂为试验材料，从中克隆了MBFlc基因。同源比对及系统进化树分析的结果显示LIMBFlc归属c亚型MBF1，具有典型的MBF1和HTH结构域。
MBF1的结构和功能在真核生物中高度保守：C-末端形成MBFlcTD。结构域，为TBP的结合域，N-末端能够结合激活蛋白，通过桥接通用转录因子TBP和基因特异性转录因子，增强特异性转录因子的DNA结合活性，促进依赖于该转录因子的基因的表达。虽然MBF1是一种核受体辅激活因子，但在常温下，AtMBFlc主要在细胞质中表达，热激则促进了它在细胞核中的表达。对LIMBFlc的生物信息学分析结果表明LIMBFlc没有明显的跨膜区域，预测其主要定位于细胞质、细胞核内。进一步的亚细胞定位显示热胁迫增强了LIMBFlc在细胞核内的相对表达，表明LIMBFlc可能介导了热激信号由细胞质向细胞核的转导，并在细胞核内进一步行使转录辅激活功能，这与对小麦TaMBFlc的研究结果类似。葡萄VvMBFlc、大麦HvMBFlc、芥蓝MBFlc、拟南芥AtMBF lc、小麦TaMBFlc受热激诱导表达，小麦Ta MBFlc启动子区域包含HSE响应元件。本研究中，37℃热胁迫显著促进了百合LIMBFlc的表达，LIMBFlc基因启动子克隆及其响应元件分析工作正在进行中。在前期工作中，我们发现Ca2+信号转导途径涉及调控百合的耐热性，有研究结果表明MBFlc的表达也受Ca2+信号系统的调控，因此我们研究了CaCl2、钙离子螯合剂EGTA处理对LIMBFlc表达的影响，发现LIMBFlc的表达受热胁迫与Ca2+处理协同诱导，表明LIMBFlc也可能通过Ca2+信号途径参与百合的高温胁迫反应。亚细胞定位与基因表达的结果表明LIMBFlc可能参与了百合的热激响应。
近年来的研究结果进一步揭示了MBFlc调控植物耐热性的机制。AtMBFlc能够结合CTAGA元件，调控DREB2A和HSFB的表达来增强拟南芥的耐热性，AtMBFlc还可以与海藻糖磷酸合成酶AtTPS5（Trehalose phosphate synthase 5）或胁迫相关蛋白AtSAP5（Stress-associated protein 5）互作，由此提高植株海藻糖的含量或HSP基因的表达量来增强拟南芥的耐热性。超表达小麦TaMBFlc水稻植株中6个HSP基因和2个TPS基因的表达量显著高于野生型，具有较好的耐热性。LIMBFlc能否真正调控百合的耐热性，需要进一步分析基因的功能。