维药毛菊苣水提取物抗炎作用的实验研究

材料与方法

1.1 药品与试剂

毛菊苣全草，采自新疆吉木萨尔县泉子街镇十八户村，药材经新疆药物研究所维药室何江副研究员鉴定，MS样品为新疆药物研究所制备，岀膏率为10.7%；地塞米松（Dexamethasone，DEX，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号：140672）；脂多糖（LPS）（sigma公司，批号：L2880）；冰醋酸（天津市福晨化学试剂厂，批号：20130112）；伊文思蓝（上海化学试剂采购供应站分装厂出品，批号：20120917）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-10酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司，批号：20140722）。

1.2 动物和细胞株

SPF级6～8周龄，昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g；由新疆实验动物研究中心提供，生产许可证号：SCXK（新）2011-0001。动物适应性喂养3 d，适应期12 h/12 h明暗交替，并观察动物毛发、排泄物、活动及体重生长情况，动物正常采食、饮食，并最终选取合格动物进入实验。小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7（中国医学科学院协和药物研究所筛选中心惠赠）。

1.3 仪器

Spectramax M2型微孔板监测系统，Molecular Devices；SP-752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；SW-CT-2FD型苏净安泰超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；XDS-1B倒置显微镜，重庆光学仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 MS对LPS诱导RAW264.7细胞NO的生成和TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达量的影响

1.4.1.1 RAW264.7细胞培养的培养与传代 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基，置于含5%CO2、37℃培养箱中培养。细胞生长至70%～80%融合后进行传代，3～4 d左右传代1次。

1.4.1.2 MTT法检测不同浓度MS对RAW264.7细胞生长的影响 取对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，依据文献方法[12-15]，测定终浓度7500、3750、1875、937.5、468.75、234.4 μg/mL的MS对RAW264.7细胞生长的影响，并计算抑制率。抑制率=（A空白对照组-A给药组）/A空白对照组×100%。

1.4.1.3 MS对细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响[16-18] 于96孔细胞培养板中每孔加入100 μL（2×105个细胞/mL）细胞悬液，将培养板置于CO2培养箱中培养12 h，每孔换成无血清的180 μL RPMI 1640培养液。先于每孔中加入DEX和5个不同浓度（“1.4.1.2”确定的无毒浓度）的MS培养液10 μL置于37℃、5%CO2培养箱中作用1 h，每个浓度设3个平行孔，另设正常对照孔（control组）、模型组（LPS组）。1 h后细胞对照孔和模型组分别加入20 μL/孔和10 μL/孔无血清的180 μL RPMI 1640培养液，其余各组每孔分别加入终浓度1 μg/mL的LPS 10 μL补足体系200 μL/孔，混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，吸取培养上清液，Griss法测定NO浓度，ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-10的浓度。

1.4.2 对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响[19]

将48只昆明种小鼠，依性别、体质量均衡随机分为模型组、DEX 9.7 mg/kg组和MS 130、260 mg/kg剂量组，共4组，每组12只，灌胃给药1次/d，连续4 d，末次给药后1 h，各鼠均尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.1 mL/10 g，随即腹腔注射0.8%冰醋酸0.2 mL/只，20 min后脱颈椎处死小鼠，剪开腹部皮肤肌肉，用6 mL生理盐水分数次洗涤腹腔，吸出洗涤液，3000 r/min（离心半径：6 cm）离心5 min，取上清液于590 nm测定吸光度值，并进行组间t检验。抑制率（%）=（A590 nm模型组-A590 nm给药组）/A590 nm模型组×100%。

1.5 统计学方法

运用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测不同浓度MS对RAW264.7细胞生长的影响

空白对照组和MS 234.4、468.75、937.5、1875、3750、7500 μg/mL剂量组测定的吸光度值见表1。

2.2 MS对细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响

LPS刺激RAW264.7细胞24 h后，与control组比较，LPS组中NO、IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白水平均显著升高。与LPS组比较，MS（15.625、31.25、62.5、125、250 μg/mL）上清中NO的含量和IL-10的分泌量均显著降低（P < 0.01），TNF-α的蛋白表达量随MS浓度的增高逐渐降低，此外250 μg/mL MS对IL-1β蛋白水平有极显著的抑制作用（P < 0.01），并且MS细胞上清中NO的分泌量和TNF-α、IL-1β、IL-10的表达量均呈现一定的剂量依赖性。见图1～3。

2.3 对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的影响

各给药组腹腔洗涤液较模型组为浅，由表2可见，与模型组比较，DEX 9.7 mg/kg组，MS 130、260 mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进均有显著的抑制作用（P < 0.01），抑制率分别为51%、49%、57%，表明MS能抑制H+所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进。

3 讨论

炎症（inflammation）是人类疾病中最常见而复杂的病理过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织，是机体清除刺激因素、对局部组织损伤进行修复的过程。大部分患者存在不同程度的炎性反应，会进一步加重疾病的发展，甚至诱发严重的肿瘤疾病。故治疗与控制患者的炎性反应，对改善疾病的治疗效果及预后具有十分重要的意义[20]。

维吾尔医将MS用于临床肝炎的治疗，现代科学研究表明，肝脏炎症坏死是导致病毒蔓延与迅速发展的关键病理学基础，在全面找出致病因子的基础上采取对症治疗才能对肝组织炎症进行有效的控制，进一步延缓肝纤维化及减少肝细胞损伤的发展[21]。此外在炎性反应过程中的两类炎症介质：促炎反应介质（如肿瘤坏死因子、IL-1等）和抗炎反应介质（如IL-10、IL-4、IL-5等），它们以自分泌、旁分泌、内分泌等作用于局部和全身，以正负反馈方式相互调控，炎性反应的转归将取决于这两大类介质的平衡，任何一方的过度优势均可造成炎症失控、内环境稳定的破坏。NO在炎症级联反应中起到关键的调节作用，尤其在炎性反应的发生和信号传导方面[22]。NO具有促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1产生的作用，NO介导和促进炎症的有力证据是在多种炎症性或免疫性动物模型中，在NO浓度显著升高过程中，抑制NO合成可使典型的炎症症状得到明显改善[23]。探讨毛苣菊水提取物的抗炎作用将有助于探明其保肝的作用机制。

在本研究中，在1 μg/mL LPS的刺激下，RAW264.7细胞分泌了炎症介质和细胞因子：NO、TNF-α、IL-1β、IL-10，而MS抑制了NO的分泌，而NO的减少可能进一步减少了LPS介导的巨噬细胞释放的炎症因子类介质TNF-α、IL-1β的分泌量，从而起到抑制炎症的作用。但IL-10在LPS的刺激下增高后，并未随着药物浓度的增高而得以抑制，从而发挥抗炎反应介质的作用，相反它随着药物浓度的增高而增高，该疑问期望在今后的实验研究中寻找到答案。

为进一步考察MS的抗炎活性，本研究选择了冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的急性炎症模型，研究结果表明：MS 130、260 mg/kg剂量组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进有显著的抑制作用（P < 0.01），抑制率分别为49%、57%，表明其能抑制H+所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进。体内外实验结果表明MS具有一定的抗炎活性。

本研究是在药典记载MS的有效剂量下开展的其抗炎作用的研究，结果显示MS具有一定的抗炎活性，但它在疾病模型中是否还能发挥其抗炎活性及如何发挥将是笔者下一步研究的重点。本课题组将结合本研究结果进一步开展其保肝、抗炎免疫调节作用的实验研究，同时开展其保肝作用物质的基础研究。

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