骨性关节炎患者疼痛抑制中TRPM8表达的临床意义研究
[摘要] 目的 研究骨性关节炎患者疼痛抑制中TRPM8表达的临床意义。方法 选择32只成年健康SD大鼠为研究对象，对其行鞘内置管，且经由弗氏佐剂构建骨性关节炎大鼠模型，将其分为NS-NS组、CFA-NS组、CFA-Menthol组和NS-Menthol组，各8组，比较4组用药前后大鼠行为学指标及TRPM8表达。结果 CFA-Menthol组大鼠给药前后大鼠抬爪次数、热痛敏分数及机械痛敏阙值比较差异有统计学意义（P<0.05）。另外CFA-NS组、CFA-Menthol组大鼠TRPM8表达明显高于NS-NS组、NS-Menthol组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 薄荷醇可以激活TRPM8受体以加强冷觉过敏，发挥冷镇痛效果。
[关键词] 骨性关节炎；疼痛抑制；TRPM8表达；意义
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）11（a）-0062-02
骨性关节炎（OA）是多发生于中老年人群的一种退行性关节病，主要与软骨退变、滑膜炎症等有关，表现为关节疼痛、肿胀等，严重影响患者生活质量。目前临床上治疗OA常见药物为透明质酸、非甾体抗炎药等，虽然能有效缓解疼痛及炎症，但副作用大。众所周知冰敷等适当冷刺激能缓解疼痛（如关节痛、偏头痛等），但过低则会加重疼痛或冷觉过敏，表明冷觉和疼痛间存在某种关联，但其作用机制还不是很了解[1]。随着分子学、生物学的不断进步，部分研究证明TRPs（瞬时受体电位离子通道）参与机体温度感知，而TRPM8（冷觉感受器受体M8）是TRPs家族的重要一员，在冷刺激感知上起重要作用[2]。该研究就此于2013年1月—2014年1月通过骨性关节炎小鼠建模试验分析TRPM8表达在疼痛抑制中的作用。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择32只成年健康SD大鼠为研究对象，鼠龄基本相近，平均体重（300.5±18.5）g，饲养在安静环境，不限制其自由活动。材料：本研究包括弗氏佐剂、微量注射器针头、显微镜、TRPM8抗体、薄荷醇等。
1.2 方法
①鞘内置管。大鼠腹腔中注射300～350 mg/kg水合氯醛，将其麻醉后于大鼠枕骨大孔处行纵切口，依次切开皮肤、皮下组织后把硬脊膜暴露出来，将其剪开待脑脊液流出后于蛛网膜下置入导管（PE-10聚乙烯），长度为7 cm左右，随后依次缝合且固定导管，同时通过向导管中注射利多卡因检查其置入是否正确；②骨性关节炎大鼠建模。水合氯醛（10%）麻醉后帮助大鼠选择俯卧位，先用乙醇消毒其右侧外踝附近皮肤，随后从外踝外侧凹陷部位用胰岛素注射器皮下穿刺，随后转向足尖，刺进腓骨、距骨间踝关节腔，进针深5 mm左右，加压后注入50 μL弗氏佐剂，退针后用棉球按压一会；③给药。把大鼠放置到固定器中，从固定器颈部口引出导管，并与胰岛素注射器连接，先向导管内注入5 μL生理盐水，确定导管通常后再注入20 μL试验用药，随后再注射一定量的生理盐水，让导管内药物完全进到鞘内。将所有大鼠分为NS-NS组、CFA-NS组、CFA-Menthol组和NS-Menthol组，各8只。模型制备后第2个星期分别注射薄荷醇或生理盐水20 μL。薄荷醇剂量为100 ug/kg。用药前后测定和记录各组大鼠抬爪次数、热痛敏分数及机械痛敏阙值等行为学指标。另外用药后1个星期将大鼠处死，将右侧L5DRG保存在灌注液中，24～48 h行石蜡包埋处理，制成4 um切片，同时行免疫组化染色，通过显微镜观察TRPM8表达。
1.3 统计方法
应用SPSS16.0统计学软件对上述相关数据进行分析，计量资料均数±标准差（x±s）表示，t检验。
2 结果
2.1 不同组别大鼠行为学指标比较
与用药前比较，CFA-Menthol组大鼠给药后大鼠抬爪次数、热痛敏分数及机械痛敏阙值有明显差异，差异有统计学意义（P<0.05）。其他组用药前后指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠TRPM8表达比较
CFA-NS组、CFA-Menthol组大鼠TRPM8表达明显高于NS-NS组、NS-Menthol组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
3.1 TRPM8在冷觉传导中的作用
相关离体实验表明，在DRG（背根神经节）细胞上可以观察到冷觉感受器受体M8与冷觉感受器受体V1共存现象，提示TRPM8可能参与伤害性冷刺激传导[3]。相关研究表明缓激肽、磷脂等炎症因子都可能激活TRPM8[4]。
冷反应的介导主要由C类神经纤维及类Aδ负责，而这些物质能产生一种或多种冷感觉。动物实验表明大鼠大部分冷反应主要与TRPM8受体有关，TRPM8通过电流能被26℃以下的温度激活，包括伤害性冷刺激[5]。但实验也发现TRPM8缺陷小鼠对非伤害性冷刺激感知能力下降，且同时失去对伤害性冷刺激的自我保护行为，另外对这些小鼠C类神经纤维及类Aδ研究发现冷刺激引发的行为反应明显减少或者缺失。可见TRPM8在冷觉传导中起重要作用[6]。
TRPM8在不同神经细胞亚群中均有表达，且不同亚群感觉能力也不一样，当TRPM8被激活后产生的冷知觉则由其他机制影响。Bautista[7]等人研究发现对于缺陷TRPM8的小鼠模型来说，它们对15～25℃的感知能力丧失，但却对15℃以下的冷温度有一定的逃避能力，这提示TRPM8的主要作用是参与非伤害性冷刺激及部分伤害性冷刺激，这从侧面反映除了TRPM8传导冷刺激外，还有其他作用机制，特别是对伤害性冷刺激起传导作用。
3.2 TRPM8在疼痛抑制中的可能机制
神经元亚群中若含有C类神经纤维及类Aδ，则可能对15～30℃、15℃以下的温度产生行为反应。相关研究表明慢性疼痛大鼠机体TRPM8（阳性C纤维、阳性Aδ纤维）上调，则表明TRPM8表达可能通过参与薄荷醇起镇痛效果[8]。Produfoot等[9]人研究发现皮肤温度下降到16℃、薄荷醇或icilin等对TRPM8受体产生刺激作用，导致其参与到神经病理性疼痛大鼠镇痛过程，且该镇痛效果无法被纳洛酮拮抗，表明TRPM8抑制疼痛的作用原理和传统阿片镇痛没有关联。但研究发现该镇痛效果却可以被II/III mGluRs拮抗剂选择性的逆转，表明TRPM8激活后镇痛作用主要由中枢介导，且依赖于II/III mGluRs。这是因为II mGluRs在初级传入感觉神经通路突触前、突触后中比较常见，而III mGluRs绝大部分分布在突触前，将II/III mGluRs激活后便可对脊髓背角传入神经引发的电位变化起抑制作用。相关文献表明培养基与切片脊髓背角、DRG的某些突触，给予薄荷醇补充后能提高突触后电位（兴奋性）频率，这和TRPM8表达阳性传入神经激活，释放出大量的谷氨酸一致[10]。骨性关节炎病发后TRPM8介导镇痛作用机制为：TRPM8阳性表达传导到神经纤维中，释放出一定量的葡萄糖（Glu），介导ivilin后达到镇痛的目的，其机制为激活伤害性传入纤维突触前或突触后II/III mGluRs，进而使疼痛相关神经损伤缓解引起。
薄荷醇具有清凉作用，可用于医用刺激药，外用有清凉止痒功效，内服可止痛，适用于头痛、咽喉痛等疾病。从表1可知，CFA-Menthol组大鼠给药前后大鼠抬爪次数、热痛敏分数及机械痛敏阙值比较差异有统计学意义（P<0.05）。表明薄荷醇的止痛作用。且表2中，CFA-NS组、CFA-Menthol组大鼠TRPM8表达明明显比NS-NS组、NS-Menthol组高，差异有统计学意义（P<0.05），从侧面表明TRPM8可以有效被薄荷醇激活，发挥其疼痛抑制作用。
另外， TRPM8不仅可以被薄荷醇、icilin激活，而且还受pH值影响，当pH值在6以下时，TRPM8对冷刺激反应完成消失；当pH值在6.5～8.1之间时，TRPM8激活温度在15～27℃之间。同时细胞内pH值变化对TRPM8激活能力影响比较大，当pH值增加到7.4时，icilin激活TRPM8能力较之前提高4倍；当pH值下降到6.5时，icilin激活TRPM8能力则明显下降。但pH值变化对薄荷醇激活TRPM8的能力基本没有影响，当icilin失去TRPM8激活能力后，薄荷醇还是可以激活TRPM8，提示TRPM8激活机制在两种及以上，但具体机制有待进一步研究。
综上所述，TRPM8表达主要作用是监测冷刺激，促成损伤后冷觉过敏以镇痛。薄荷醇不仅具有镇痛作用，而且还可以激活TRPM8受体加强冷觉过敏，以充分发挥冷镇痛效果，但TRPM8在骨性关节炎疼痛抑制中的作用机制需进一步研究。
[参考文献]
[1] 曹燕卿.低温对大鼠真皮微血管内皮细胞的影响及TRPM8参与调控的机制[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2013.
[2] 苏林，王国林.TRPM8与神经病理性疼痛[J].国际麻醉学与复苏杂志，2011，32（1）：96-100.
[3] 秦冬梅，李晶，欧阳颖，等.TRPM8离子通道在偏头痛发生中的作用[J].实用疼痛学杂志，2012，8（6）：456-459.
[4] 马洪明，刘升明，陈万群.哮喘小鼠肺组织TRPM8与TRPA1mRNA的表达[J].广东医学，2012，33（6）：750-752.
[5] 刘祥鹏.TRPM8在慢性非细菌性前列腺炎SD大鼠前列腺组织的表达及意义[D].合肥：安徽医科大学，2012.
[6] 苏林，王国林.TRPM8与神经病理性疼痛[J].国际麻醉学与复苏杂志，2011，32（1）：96-100.
[7] ProudfootCJ，GarryEM，CottrellDF，et al.Analgesia mediated by the TRPM8 cold receptor in chronic neuropathic pain[J].Curr Biol，2006，16（16）：1591-605.
[8] 李敏超，Juliy M，Perelman，Victor P，Kolosov，等.瞬时受体电位M8离子通道对冷刺激诱导气道上皮细胞炎症反应的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2011，34（10）：757-761.
[9] BautistaDM，SiemensJ，GlazerJM，et al.The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold[J].Nature，2007，448（7150）：204-208.
[10] 任永颖，王超，王国林.关节炎大鼠背根神经节TRPM8在冷觉过敏形成中的作用[J].山东医药，2010，50（19）：42-44.
（收稿日期：2014-08-06）